A-immunomodulateur ayeke mbeni kota ye so ayeke na yâ ti micro-environnement ti tumeur (TME), me gi ambeni kete ye, a hinga pëpe mingi ti ala. Na ndo so, a gi nda ti a-tumor nga na a-cellule T so alondo na yâ ti a-tumor nga na a-ascite ti azo so ayeke na kobela ti cancer ti kota grade (HGSC) ti fa na gigi métabolisme ti acompartiment ti TME nde nde so. Ascite na acellule ti tumeur ayeke na akota kangbi na popo ti ala. Tongana a haka ni na ascite, a-cellule T so ayeke lï na yâ ti tumeur ni ayeke na gbâ ti 1-méthylnicotinamide (MNA). Atâa so wungo ti MNA so ayeke na yâ ti acellule T ayeke gue na li ni, a yeke wara gi na yâ ti a-fibroblaste nga na a-cellule ti tumeur (mbeni enzyme so ayeke sara si abungbi ti méthyle so alondo na S-adénosylméthionine ti gue na nicotinamide). Na lege ti kusala, MNA ayeke pusu a-cellule T ti sigigi na cytokine so ayeke sara si tumeur ni akono, so ayeke facteur alpha. Tongaso, MNA so alondo na TME ayeke mû maboko ti tene a-immune ti a-cellule T abâ gigi nga a yeke mbeni ye so alingbi ti sara kua na immunothérapie ti sava na cancer ti zo.
A-métabolite so alondo na yâ ti a-tumor alingbi ti kanga lege mingi na ngangu ti tele ti zo ti tiri na a-tumor, na aye mingi afa so ala lingbi nga ti sala kusala tongana mbeni kota ye so ayeke pusu kobela ti gue na li ni (1). Na ndo ti ye so a iri ni Warburg effect, a to nda ti sara ambeni kua ade ti ninga pëpe ti hinga ye so ayeke si na yâ ti acellule ti tumeur nga na songo so ayeke na popo ti aye so ayeke na yâ ti acellule ti tumeur (TME). Ambeni gingo nda ti ye na ndo ti asusu nga na acellule T ti zo afa so glutamine (2), oxidatif (3) nga na glucose (4) alingbi ti sara kua gi ala oko na ndo ti akete groupe ti acellule nde nde so ayeke bata terê ti zo. Ambeni ye so ayeke na yâ ti alege so ayeke kanga lege na kusala ti acellule T so ayeke tiri na a-tumor. A fa so kangango lege na coenzyme tétrahydrobioptérine (BH4) alingbi ti buba wungo ti acellule T, na guengo na li ni ti BH4 na yâ ti tere ti zo alingbi ti sara si a-immune ti terê ti zo so ayeke tiri na a-tumor so ayeke na lege ti CD4 na CD8 akiri aga nzoni. Na ndo ni, a lingbi ti zi ngangu ti kynurenine na lege ti mungo na zo BH4 (5). Na yâ ti glioblastoma so ayeke na yâ ti a-isocitrate déhydrogénase (IDH), a yeke wara a-énergie (R-2-HG) so ayeke kanga lege na a-cellule T ti sara kua, ti kono nga ti sara kua ti cytolyse (6). A ninga pëpe, a fa so méthylglyoxal, mbeni ye so ayeke na yâ ti glycolyse, ayeke sigigi na lege ti acellule so ayeke kanga lege na cellule so alondo na myéloïde, na a-cellule T so ayeke mû méthylglyoxal na zo alingbi ti kanga lege na kusala ti a-effecteur T so ayeke sara kua. Na yâ ti akode ti kaïngo kobela, neutralisation ti méthylglyoxal alingbi ti hon ndo ti kusala ti a-cellule so ayeke kanga lege na myéloïde (MDSC) nga ti sara si a-appareil ti kaïngo kobela ti checkpoint akiri aga nzoni na yâ ti a-modèle ti asusu (7). A-étude so kue afa kota kusala so a-métabolite so alondo na TME ayeke sara ti leke kusala nga na kusala ti a-cellule T.
Azo mingi abâ so acellule T ayeke sara kua nzoni pëpe na yâ ti cancer ti ovarium (8). Ye so ayeke si ngbanga ti so ambeni ye so ayeke na yâ ti mênë ti zo ayeke sara kua nzoni pëpe nga na yâ ti mênë ti zo so ayeke na yâ ti tumeur (9), so ayeke sara si glucose na tryptophane aga ambeni ye so ayeke na yâ ti terê ti zo tongana acide lactique nga na kynurénine. Ti mû lactate mingi na yâ ti acellule ti zo ayeke sara si interféron-γ (IFN-γ) abâ gigi pëpe nga ayeke sara si akete groupe ti myélosuppresseur ayeke sara kua nde ( 10, 11 ). Ti te tryptophane ayeke kanga lege na a-cellule T ti kono mingi nga ti kanga lege na a-récepteur ti a-cellule T ti sara kua ( 12-14 ). Atâa so a bâ aye so, a sara gbâ ti akua so angoro métabolisme ti terê ti zo na yâ ti culture ti acellule T in vitro na lege ti ambeni ye so a leke ni nzoni, wala a sara kua gi na a-homologue ti souris in vivo, so mbeni oko ti ala afa pëpe na lege ni hétérogénéité ti a-cancer ti azo nga na environnement physiologique macro na micro.
Mbeni ye so ayeke si ka mingi na azo so ayeke na cancer ti ovarium ayeke so péritoine ni ayeke mû ndo nga so a yeke sigigi na ascite. Ti bungbi ngu ti acellule na yâ ti ascite ayeke sara si kobela ni ague na li ni mingi nga zo ayeke wara kpale ti seni (15). Na lege ti ambeni tondo, ndo so ayeke nde so ayeke na hypoxie, a yeke wara gbâ ti aye so ayeke sara si a-endothélium ti yâ ti mênë akono (VEGF) nga na indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO), nga a yeke wara na yâ ti ni a-cellule T so ayeke sara si a-organe ti mênë abâ gigi nga na a-cellule so ayeke kanga lege na a-myéloïde (15-18). Ndo so ascite ayeke sara kua dä alingbi ti duti nde na ti tumeur ni wani, tongaso a yeke polele pëpe tongana nyen la a yeke kiri ti leke yâ ti acellule T na yâ ti place ti péritoine. Na ndo ni, akota kangbi nga na hétérogénité so ayeke na popo ti ascite na a-métabolite so ayeke na yâ ti a-tumor ni alingbi ti kanga lege na lingo ti a-immune cellule nga na kusala ti ala na ndo ti a-tumor ni, na a hunda ti sara ambeni gingo nda ti ye nde.
Ti leke akpale so, a leke mbeni kode ti kangbingo yâ ti acellule so ayeke sensible nga na ti spectrométrie ti masse tandem ti chromatographie liquide (LC-MS/MS) ti manda na mara ti acellule nde nde (so na popo ni a yeke wara acellule CD4 + na CD8 + T) nga na yâ ti a-tumor nga na popo ti ala. A yeke sala kusala na kode so legeoko na cytométrie ti flux ti kota dimension nga na séquencement ti ARN ti mbeni cellule oko (scRNA-seq) ti mû mbeni foto so a leke ni nzoni mingi na ndo dutingo ti métabolisme ti akota bungbi ti azo so. Kode so afa so wungo ti 1-méthylnicotinamide (MNA) so ayeke na yâ ti acellule T ti tumeur ni ague na li ni mingi, na a-expérience so a sara na yâ ti a-in vitro afa so a hinga kozo pëpe ngangu so MNA ayeke sara ti tene acellule T asara kua nzoni. Na yâ ti aye kue, kode so afa na gigi asarango ye so ayeke na popo ti a- tumeur na a-immune cellule, nga amû lege na e ti hinga ye so ayeke nde na ndo ti a-immunothérapie so ayeke sara si a-immunothérapie ti cancer ti ovaire abâ gigi na lege ti a-cellule T.
A yeke sara kua na cytométrie ti ga na akota ye ti tene a hinga na oko ngoi ni wungo ti glucose so a mû na yâ ti tere ti zo. a yeke wara na yâ ti a-immune a-immune nga na a-tumeur (Tableau S2 na Figure S1A). Gingo nda ti ye so afa so tongana a haka ni na a-cellule T, a-ascite na a-cellule ti tumeur ayeke mû glucose mingi, me ala yeke na akete kangbi na yâ ti kusala ti mitocondrie. A yeke wara na yâ ti a-cellule ti tumeur [CD45-EpCAM (EpCAM)+] fani ota ti si na osio wungo ti glucose so ayeke na yâ ti a-cellule T, na wungo ti glucose so ayeke na yâ ti a-cellule ti CD4 + T ayeke fani 1,2 ti a-cellule ti CD8 + T, so afa so a-lymphocyte so ayeke lï na yâ ti tumeur (TIL) ayeke na ambeni ye nde nde). Nde na so, kusala ti mitochondrie na yâ ti acellule ti tumeur ni ayeke legeoko na ti acellule CD4 + T, na kusala ti mitochondrie ti mara ti acellule use so ayeke ga kota ahon ti acellule CD8 + T (Foto 1B). Na yâ ti aye kue, aye so afa nivo ti métabolisme ti zo. A yeke wara na yâ ti a-cellule ti tumeur ni aye so ayeke sara si a-cellule CD4 + T ayeke sara kua nzoni, na a-cellule CD4 + T ayeke sara kua nzoni ahon a-cellule CD8 + T. Atâa so a yeke wara aye so na popo ti mara ti acellule nde nde, mbeni kangbi ayeke dä pëpe na popo ti dutingo ti acellule CD4 + na CD8 + T wala wungo ti ala na yâ ti ascite tongana a haka ni na tumeur (Foto 1C). Nde na so, na yâ ti mbage ti acellule CD45, wungo ti acellule ti EpCAM+ so ayeke na yâ ti tumeur ni ague na li ni mingi tongana a haka ni na ascite (Foto 1D). A bâ nga so mbeni kangbi ayeke polele na popo ti akota mbage ti EpCAM+ na ti EpCAM- cellule. A-cellule ti EpCAM+ (tumeur) ayeke na kota glucose nga na kusala ti mitochondrie ahon a-cellule ti EpCAM-, so ayeke kota mingi ahon kusala ti métabolisme ti a-fibroblaste na yâ ti a-cellule ti tumeur na yâ ti TME (Foto 1, E na F).
(A na B) Ngangu ti fluorescence ti moyen (MFI) ti mungo glucose (2-NBDG) (A) nga na kusala ti mitochondrie ti acellule CD4 + T (MitoTracker rouge foncé) (B) Agraphe so ayeke fa ye (na mbage ti koli) nga na asango so a zia na yâ ti tableau (na mbage ti wali), acellule ti CD8 + T nga na acellule ti tumeur ti EpCAM + CD45-. (C) Wungo ti acellule CD4 + na CD8 + (ti acellule CD3 + T) so ayeke na yâ ti ascite nga na tumeur. (D) Wungo ti EpCAM + so ayeke na yâ ti a-ascite nga na a-tumor (CD45−). (E na F) EpCAM + CD45-tumeur na EpCAM-CD45-matrix ti glucose so a mû (2-NBDG) (E) na kusala ti mitocondrie (MitoTracker rouge foncé) (F) agraphe so afa ye (na mbage ti koli) nga na asango so a zia na yâ ti tableau ( Na mbage ti wali) Ascite na acellule ti tumeur. (G) A-graphe so afa CD25, CD137 na PD1 na lege ti cytométrie ti flux. (H na I) CD25, CD137 na PD1 so ayeke na yâ ti a-cellule CD4 + T (H) nga na a-cellule CD8 + T (I). (J na K) Azo so ayeke na mémoire centrale (Tcm), so ayeke sara kua (Teff) nga na azo so ayeke na mémoire (Tem) so aluti na ndo ti fango peko ti CCR7 na CD45RO. A-image so afa (na mbage ti koli) nga na asango so ayeke na yâ ti tableau (na mbage ti wali) ti a-cellule CD4 + T (J) nga na a-cellule CD8 + T (K) so ayeke na yâ ti ascite nga na a-tumor. A yeke wara na yâ ti t-test use (*P<0,05, **P<0,01 na ***P<0,001). Molongo ni afa azo ti kobela so alingbi tere (n = 6). FMO, fluorescence so ayeke na yâ ni; MFI, ngangu ti fluorescence ti moyen.
Mbeni gingo nda ti ye nde afa ambeni kota kangbi nde na popo ti dutingo ti a-cellule T so a leke ni nzoni mingi. A-activé (Foto 1, G ti si na I) nga na a-effecteur (Foto 1, J na K) na yâ ti a-tumor ayeke mingi ahon ascite (wungo ti a-cellule CD3 + T). Legeoko nga, tongana a gi nda ti fä ni na lege ti fango na gigi a-activation (CD25 na CD137) nga na a-marqueur ti déplétion [protéine ti kuâ ti acellule so a programmé ni 1 (PD1)], a fa so atâa so asarango ye ti azo so ayeke nde (Foto S1, B ti si na E) , Me mbeni kota kangbi ti métabolisme so ayeke na popo ti memory wala S1 ayeke dä pëpe. F ti si na I). A yeke na lege ni ti tene e sara kua na akode ti mandango ye na lege ti masini ti mû na azo a-aphénotype ti acellule (21), ye so afa nga so gbâ ti a-cellule ti moelle osseuse (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ayeke na yâ ti ascite ti zo ti kobela ni (Foto S2A ). Na popo ti mara ti acellule kue so a hinga ni, wungo ti acellule myéloïde so afa so lo yeke mû glucose mingi nga lo yeke sara kua mingi na yâ ti a-mitochondrie (Foto S2, B ti si na G). Atondo so afa ngangu kangbi so ayeke na popo ti mara ti acellule mingi so a wara na yâ ti ascite nga na a- tumeur so ayeke na yâ ti azo so ayeke na kobela ti HGSC.
Kota kpale so ayeke na yâ ti hingango ye na ndo ti asarango ye ti métabonome ti TIL ayeke so a lingbi a zi ambeni échantillon ti acellule T so ayeke nzoni-kue, so ayeke nzoni nga so ayeke mingi na yâ ti a-tumor. Ambeni gingo nda ti ye so asi ade ti ninga pëpe afa so akode ti kangbingo yâ ti aye nga na ti sarango si aperle ni aga nzoni so aluti na ndo ti cytométrie ti flux alingbi ti sara si achangement asi na yâ ti aprofil ti amétabolite ti acellule ( 22-24 ). Ti hon ndo ti kpale so, a leke kode ti enrichissement ti perle ti zi na ti zi TIL na yâ ti cancer ti ovarium ti zo so a zi ni na lege ti opération kozoni si a sara analyse ni na lege ti LC-MS/MS (bâ Matériaux et méthodes; Figure 2A). Ti bâ ngangu so protocole so ayeke sara na ndo ti achangement so ayeke na yâ ti a-métabolite, a haka a-métabolite ti a-cellule T so azo so amû mênë na ala so ayeke na nzoni seni asara kua na ni na peko ti so a sara tënë ti kangbingo yâ ti a-perle so a fa na nduzu ge na a-cellule so a kangbi yâ ti a-perle ni pëpe me so angbâ na ndo ti glace. Azo so abâ lege ti nzoni ti aye so abâ so mbeni kota kamba ayeke na popo ti aye use so (r = 0,77), na lege ti senda-ye ti groupe ti amétabolite 86 so ayeke na kota lege ti kiri ti sara ye (Foto 2B). Tongaso, akode so alingbi ti sala tâ gingo nda ti ye na ndo ti a-métabolite na yâ ti acellule so ayeke na yâ ti mbeni ye so a iri ni enrichissement ti mara ti acellule, na tongaso a mû kozo plateforme so ayeke na kota résolution ti hinga na ambeni mbilimbili métabolite so ayeke na yâ ti HGSC, na tongaso a mû lege na azo ti wara mbeni hingango ye so alï mingi na ndo ti mbilimbili ti acellule Programme ti métabolisme ti bungbingo koli na wali.
(A) Schéma ti enrichissement ti perle magnétique. Kozoni si a bâ yâ ti acellule ni na lege ti LC-MS/MS, a yeke sara si acellule ni aga nzoni fani ota wala a yeke ngbâ na ndo ti glace. (B) Ye so mara ti enrichissement ni ayeke sara na ndo ti gbâ ti a-métabolite. Moyenne ti amesure ota ti mara ti mosoro oko oko ± SE. Molongo ti gris ni afa mbeni songo so ayeke 1:1. A yeke wara na yâ ti klase ni (ICC) amesure so a kiri a sara ni so a fa ni na yâ ti étiquette ti axe ni. NAD, so ayeke mbeni ye so ayeke na yâ ti nicotinamide. (C) Schéma ti kusala ti gingo nda ti métabolite ti azo ti kobela. A yeke mû ascite wala a- tumeur na yâ ti azo ti kobela na a bata ni na cryopreservation. A bâ mbeni kete mbage ti échantillon oko oko na lege ti cytométrie ti flux, na a sara tanga ti a-échantillon ni na yâ ti atour ota ti tene a wara a-cellule CD4+, CD8+ nga na CD45-. A bâ yâ ti ambage ti acellule so na lege ti LC-MS/MS. (D) Carte ti chaleur ti wungo ti amétabolite so a leke ni nzoni. Dendrogramme ni afa bungbingo ti Ward ti akota ndo ti Euclide so ayeke na popo ti a-échantillon. (E) Analyse ti akota ye (PCA) ti carte ti métabolite ti échantillon, so afa a-échantillon ota so a kiri pekoni, a-échantillon so alondo na oko zo ti kobela ni abungbi ni na lege ti mbeni ligne. (F) PCA ti profil ti métabolite ti échantillon so a leke ni na ndo ti zo ti kobela (so ti tene, salango kusala na redondance ti mbage ni); mara ti échantillon ni ayeke na yâ ti coque ti convexe. PC1, kota mbage 1; PC2, kota mbage 2.
Na pekoni, a sala kusala na kode ti salango si ye aga mosoro so ti gi nda ti a-métabolite 99 so ayeke na yâ ti akete mbage ti CD4 +, CD8 + na CD45 so ayeke na yâ ti akozo ascite nga na a-tumor ti azo omene so ayeke na kobela ti HGSC (Foto 2C, Foto S3A nga na Tableau S3 na S4). Azo so ayeke gi nda ti ye ayeke 2% ti si na 70% ti kozo kota échantillon ti acellule so ayeke na fini, na wungo ti acellule ni ayeke nde nde mingi na popo ti azo ti kobela. Na peko ti so a kangbi yâ ti aperle ni, mbage ti ye so a sara si a yeke ngangu pëpe ti wara ni (CD4+, CD8+ wala CD45-) ayeke ahon 85% ti acellule kue so ayeke na fini na yâ ti échantillon ni na moyenne. Kode ti sarango si ye aga mosoro so amû lege na e ti bâ wungo ti acellule so alondo na yâ ti anyama so ayeke na yâ ti tumeur ti zo, ye so zo alingbi pëpe ti sara ni na lege ti akota échantillon. Na lege ti protocole so, a bâ so l-kynurenine na adenosine, so ayeke a-immunosuppresseur use so ayeke nzoni, ayeke na yâ ti a-cellule T ti tumeur wala na yâ ti a-tumeur (Foto S3, B na C). Tongaso, aye so asi afa so kode ti kangbingo yâ ti acellule ti e nga na ti spectrométrie ti masse ayeke be-ta-zo nga ayeke na ngangu ti wara akota ye so ayeke na yâ ti anyama ti zo ti kobela.
Azo so abâ ye ni afa nga so mbeni ngangu kangbingo popo ti mara ti acellule ayeke na yâ ti azo ti kobela nga na popo ti ala (Foto 2D na Figure S4A). Na yâ ti ambeni ye, tongana a haka ni na ambeni zo ti kobela, azo ti kobela 70 afa so ala yeke na asarango ye nde nde (Foto 2E na Figure S4B), so afa so a lingbi ti wara akota kangbi na popo ti azo ti kobela ni. A yeke nzoni ti hinga so tongana a haka ni na ambeni zo ti kobela (litre 1,2 ti si na 2; Tableau S1), wungo ti ascite kue so a bungbi na yâ ti zo ti kobela 70 (80 ml) ayeke kete. Na ngoi so a yeke sara kua na a-analyse ti akota composant (na tapande, a yeke sara kua na a-analyse ti redondance partielle), a yeke wara achangement so ayeke si lakue na popo ti mara ti acellule, na a yeke bungbi mara ti acellule ni nga na/wala microenvironnement ni polele alingbi na profil ti métabolite ni (Foto 2F ). Gingo nda ti aye so ayeke na yâ ti a-métabolite oko oko agboto lê mingi na ndo ti aye so na afa so akota kangbi ayeke na popo ti mara ti acellule nga na akete kete ye so ayeke na yâ ti tere ti zo. A yeke nzoni ti hinga so kangbi so ayeke kota mingi so a bâ ayeke MNA, so mingi ni a yeke wara na yâ ti a-cellule CD45- nga na a-cellule CD4+ na CD8+ so ayeke lï na yâ ti tumeur ni (Foto 3A). Ti acellule CD4 +, ye so ayeke si polele mingi, na a bâ nga so MNA so ayeke na yâ ti acellule CD8 + ayeke sara ngangu na ndo ti aye so ayeke na yâ ti ndo ni. Ye oko, ye so ayeke kota ye pëpe, teti so gi azo ota na popo ti azo omene so alingbi ti bâ wala ala yeke na CD8+ ti tumeur. Na ndo ti MNA, na yâ ti mara ti acellule nde nde so ayeke na yâ ti ascite nga na a-tumor, ambeni ye so ayeke na yâ ti TIL ayeke nga na mosoro nde nde (Afoto S3 na S4). Tongaso, asango so afa mbeni bungbi ti a-immunomodulateur so ayeke mû zendo ti tene a sara ambeni gingo nda ti ye na ndo ni.
(A) A yeke wara na yâ ti acellule ti CD4+, CD8+ nga na CD45- so alondo na ascite nga na tumeur. Na yâ ti boîte ni, a yeke wara médian (ligne), range ti interquartile (charnière ti cadre) nga na range ti asango, juska fani 1,5 ti range ti interquartile (moustache ti cadre). Tongana ti so a fa na yâ ti mbeti ti azo ti kobela, a sara kua na limma ti azo ti kobela ti hinga na ngere ti P (*P<0,05 na **P<0,01). (B) Schéma ti métabolisme ti MNA (60). A yeke wara na yâ ti mênë ti zo: S-adénosyle-1-méthionine; SAH, so ayeke S-adénosine-1-homocystéine; NA, yorö ti nikoti; MNA, 1-méthylnicotinamide; 2-PY, 1-méthyl- 2-piridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-méthyl-4-piridone-5-carboxamide; NR, ribose ti nicotinamide; NMN, mbeni ye so ayeke na yâ ti nicotinamide. A-enzyme (so ayeke vert): NNMT, so ayeke mbeni ye so ayeke mû lege na zo ti sara ye; SIRT, akota zo ti kodoro; NAMPT, mbeni ye so ayeke sara si nicotinamide ayeke sara kua nzoni; AOX1, so ayeke mbeni ye so ayeke na yâ ti aldéhyde; NRK, so ayeke mbeni ye so ayeke na yâ ti nicotinamide; NMNAT, so ayeke mbeni ye so ayeke mû lege na zo ti sara kua na ni; Pnp1, so ayeke mbeni nucléoside ti purine. (C) t-SNE ti scRNA-seq ti ascite (gris) na ti tumeur (rouge; n = azo ti kobela 3). (D) NNMT afa na yâ ti abungbi ti acellule nde nde so a hinga ni na lege ti scRNA-seq. (E) Fango NNMT na AOX1 na yâ ti SK-OV-3, rein ti zo (HEK) 293T, a-cellule T nga na a-cellule T so a sara kua na MNA. A fa tënë ti plié ni na lege ti SK-OV-3. A fa lege ti salango ye na SEM (n = 6 azo so ayeke na nzoni seni). A yeke bâ wungo ti Ct so ahon 35 tongana ye so a lingbi ti hinga ni pëpe (UD). (F) Fango peko ti SLC22A1 na SLC22A2 na yâ ti SK-OV-3, HEK293T, a-cellule T nga na a-cellule T so a sara kua na MNA 8mM. A fa tënë ti plié ni na lege ti SK-OV-3. A fa lege ti salango ye na SEM (n = 6 azo so ayeke na nzoni seni). A yeke bâ wungo ti Ct so ahon 35 tongana ye so a lingbi ti hinga ni pëpe (UD). (G) MNA ti acellule so ayeke na yâ ti acellule T so ayeke na nzoni seni so a sara kua na ni na peko ti so a sara ngbonga 72 na yâ ti MNA. A fa lege ti salango ye na SEM (n = 4 azo so ayeke na nzoni seni).
A yeke sara MNA na lege so a yeke mû groupe ti méthyle so alondo na S-adénosyl-1-méthionine (SAM) ti gue na ni na nicotinamide (NA) na lege ti nicotinamide N-méthyltransférase (NNMT; Tapande 3B). NNMT ayeke na yâ ti a-cancer nde nde ti azo na a yeke sara si a-cancer ni akiri aga mingi, a-invasion nga a-métastase (25-27). Ti hinga nzoni mingi lingu ti MNA so ayeke na yâ ti acellule T na yâ ti TME, a sara kua na scRNA-seq ti fa na gigi mara ti NNMT so ayeke na yâ ti a-ascite nga na a-tumor ti azo ota so ayeke na kobela ti HGSC (Tableau S5). Na ngoi so a gi nda ti acellule ndulu na 6 500, a fa so na yâ ti ando so a yeke wara ascite nga na a- tumeur dä, a yeke wara NNMT gi na yâ ti a-fibroblaste nga na a-tumeur so a tene a yeke wara ni (Foto 3, C na D). A yeke nzoni ti hinga so mbeni ye so afa polele so NNMT ayeke na yâ ti mbeni bungbi ti azo so ayeke fa PTPRC (CD45 +) (Foto 3D na Foto S5A), so afa so a zia MNA so a wara na yâ ti spectre ti amétabolite na yâ ti acellule T. A yeke wara na yâ ti a-aldéhyde oxidase 1 (AOX1) MNA so ayeke sara si MNA aga 1-méthyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) wala 1-méthyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR); Figure 3B) ayeke nga gi na ndo ti wungo ti afibroblaste so ayeke fa COL1A1 (Foto S5A), so kue afa so a-cellule T ayeke na ngangu pëpe ti sara kua na MNA so ayeke na yâ ti a-organisme. A yeke na lege ni ti tene a sara kua na mbeni use bungbi ti asango ti acellule so ayeke nde so alondo na ascites so alondo na azo ti kobela ti HGSC (Foto S5B; n = 6) (16). Na ndo ni, gingo nda ti ye na lege ti chaîne ti polymérase (qPCR) na ndo ti a-cellule T so ayeke na nzoni seni so a mû na ala MNA afa so tongana a haka ni na a-cellule ti tumeur ti ovarien SK-OV-3 so a mû na ala, NNMT wala AOX1 ayeke dä pëpe (Foto 3E). Aye so asi so zo aku tere ti lo na ni pëpe afa so a lingbi ti sigigi na MNA na yâ ti a-fibroblaste wala na yâ ti a-tumor ti lï na yâ ti a-cellule T so ayeke na tere ni na yâ ti TME.
Atâa so a yeke wara na yâ ti sewa ti a-organique so ayeke mû a-cation 1 ti si na 3 (OCT1, OCT2 na OCT3) so a codé ni na yâ ti sewa ti a-organique so ayeke mû a-organique (SLC22A1, SLC22A2 na SLC22A3), a ngbâ ti hinga pëpe azo so alingbi ti mû MNA (28). QPCR ti mRNA so alondo na yâ ti a-cellule T so ayeke na nzoni seni afa so SLC22A1 ayeke mingi pëpe me SLC22A2 ayeke mingi pëpe, ye so afa so a sara tënë ni kozo awe na yâ ti ambeti (Foto 3F) (29). Nde na so, SK-OV-3 so ayeke na yâ ti a-ovaire afa so a yeke ga na akota ye use so ayeke mû lege na zo ti hon (Foto 3F).
Ti tara ti bâ wala a-cellule T ayeke na ngangu ti mû MNA ti kodoro wande, a bata a-cellule T so ayeke na nzoni seni teti angbonga 72 na ndo so a yeke wara gbâ ti MNA nde nde dä. Na yâ ti MNA so ayeke exogène, a lingbi ti wara na yâ ti acellule ti MNA ni (Foto 3G). Me, a-activé T cellule so a sara kua na MNA exogène afa so wungo ti MNA so ayeke na yâ ti acellule ni ayeke gue na li ni alingbi na dose ni, juska na MNA 6 mM (Foto 3G). Ye so asi afa so atâa so wungo ti transporteur ni ayeke mingi pëpe nga kota enzyme so ayeke sara si MNA so ayeke na yâ ti acellule ni achangé ayeke dä pëpe, TIL alingbi ti ngbâ ti mû MNA ni.
A yeke wara na yâ ti a-cellule T ti azo ti kobela gbâ ti a-métabolite nga na a-expérience so a sara ti mû MNA na yâ ti a-in vitro asara si a-fibroblaste so ayeke na yâ ti cancer (CAF) ayeke sigigi na MNA na a-cellule ti tumeur alingbi ti leke yâ ti TIL nga na kusala ti lo. Ti hinga ngangu so MNA ayeke sara na ndo ti acellule T, a sara si a-cellule T so ayeke na nzoni seni asara kua na yâ ti a-in vitro na yâ ti mbeni ye so MNA ayeke dä wala pëpe, na a bâ tongana nyen la ala yeke kono nga na lege so ala yeke sara na a-cytokine. Na peko ti lango 7 so a zia MNA na yâ ni na kota dose, wungo ti azo so ague na li ni use adë na mbeni lege so ayeke na lege ni, na ngoi so a bata ngangu na ndo ti dose kue (Foto 4A). Na ndo ni, salango kusala na MNA so ayeke na gigi asala si wungo ti acellule CD4 + na CD8 + T so ayeke fa facteur ti nécrose ti tumeur-α (TNFα; Tapande 4B) ague na li ni. Nde na so, a yeke wara na yâ ti acellule ti IFN-γ so ayeke na yâ ti acellule CD4 + T, me pëpe na yâ ti acellule ti CD8 + T, nga a yeke wara pëpe mbeni kota gbiango ye na yâ ti interleucine 2 (IL-2; Tapande 4, C na D). Tongaso, a-enzyme-lié immunosorbant assay (ELISA) ti a-surnatant so alondo na yâ ti a-cellule T so a sara kua na MNA so afa so TNFα ague na li ni mingi, IFN-γ akiri na peko nga IL-2 achangé pëpe (Foto 4, E ti si na G). . Ti tene IFN-γ adë afa so MNA alingbi ti sara mbeni kua ti kanga lege na kusala ti acellule T so ayeke tiri na a-tumor. Ti tene a leke ngangu ti MNA na ndo ti acellule T so ayeke sara si mênë ti zo aga sioni, a yeke sara kua na a-antigène chimérique T (FRα-CAR-T) so ayeke sara kua na a-antigène chimérique so ayeke sara kua na a-antigène α nga na a-cellule ti CAR-T (GFP) so a leke ni na lege ti a-cellule ti protéine fluorescente verte (GFP) -CAR-T so ayeke na nzoni seni ( mononucle ti mênë ti zo so amû mênë). A zia na yâ ti acellule ti CAR-T teti angbonga 24 na gbele MNA, na pekoni a zia na yâ ti acellule ti tumeur ti ovarium ti zo SK-OV-3 so ayeke fa récepteur ti folate α na mbeni ratio ti effecteur na cible so ayeke 10:1. Na lege ti MNA, a sara si a yeke ngangu ti fâ a-cellule ti FRα-CAR-T, so ayeke legeoko na a-cellule ti FRα-CAR-T so a sara kua na adénosine (Foto 4H).
(A) Total ti acellule so ayeke na fini nga na double ti wungo ti azo (PD) directement de la culture na lango 7. Graphique ti barre ni afa moyenne + SEM ti azo omene so amû mênë na ala so ayeke na nzoni seni. A fa asango so alondo na kamême n = 3 ti a-expérience so ayeke nde. (B ti si na D) A sala kusala na CD3/CD28 na IL-2 ti sala si a-cellule T asala kusala na yâ akota wungo ti MNA ti ala oko oko teti lango 7. Kozoni si a gi nda ti ye, a mû na ala PMA/ionomycine na GolgiStop teti angbonga 4. TNFα (B) ayeke na yâ ti acellule T. Tapande ti image (na mbage ti koli) nga na asango so ayeke na yâ ti tableau (na mbage ti wali) ti TNFα so ayeke na yâ ti acellule so ayeke na fini. IFN-γ (C) na IL-2 (D) ayeke na yâ ti acellule T. A mû mesure ti fango peko ti acytokine na lege ti cytométrie ti flux. Graphique ti barre ni afa moyenne (n = 6 ti azo so ayeke na nzoni seni) + SEM. Lo sara kua na mbeni analyse ti variance nga na amesure so a kiri a sara ni (*P<0,05 na **P<0,01) ti hinga na ngere ti P. A fa asango so alondo na kamême n = 3 ti a-expérience so ayeke nde. (E ti si na G) A sala kusala na CD3/CD28 na IL-2 ti sala si a-cellule T asala kusala na yâ akota wungo ti MNA ti ala oko oko teti lango 7. A bungbi a-étude ni kozoni na peko ti ngbonga 4 ti stimulation ti PMA/ionomycine. A yeke wara na yâ ti mênë ti zo TNFα (E), IFN-γ (F) nga na IL-2 (G) na lege ti ELISA. Graphique ti barre ni afa moyenne (n = 5 so ayeke na nzoni seni) + SEM. A fa ngere ti P na lege ti mbeni gingo nda ti ye oko ti variance nga na amesure so a kiri a mû ni (*P<0,05). Ligne so ayeke na point afa limite ti détection ti détection ni. (H) Tes ti lyse ti acellule. A leke a-cellule ti FRα-CAR-T wala ti GFP-CAR-T na adénosine (250μM) wala na MNA (10 mM) teti angbonga 24, wala a zia ni pëpe (Ctrl). A mû wungo ti azo so akui na yâ ti acellule ti SK-OV-3. A yeke wara na yâ ti test ti t ti Welch (*P<0,5 na **P<0,01).
Ti wara mbeni hingango ye na ndo ti lege so a yeke sara kua na TNFα so ayeke na lege ti MNA, a bâ achangement so ayeke si na yâ ti mRNA ti TNFα ti acellule T so a sara kua na MNA (Foto 5A). A-cellule T so ayeke na nzoni seni so a mû na ala MNA afa so wungo ti TNFα so ayeke na yâ ti mênë ti ala ague na li ni fani use, so afa so MNA ayeke zia bê ti lo na ndo ti lege so TNFα ayeke sara kua na ni. Ti gi nda ti ye so alingbi ti si, a bâ ambeni ye use so a hinga ni nzoni so ayeke sara si TNFα ayeke sara kua nzoni, so ti tene facteur nucléaire ti cellule T so asara kua (NFAT) nga na mbeni protéine 1 (Sp1), so ayeke sara si MNA abungbi na proximal promoteur ti TNFα ( 30 ). Na yâ ti promoteur ti TNFα, a yeke wara ando 6 so a hinga ni so ayeke tingbi na NFAT nga na ando 2 so ayeke tingbi na Sp1, so abungbi tere na ndo ti mbeni ndo oko [-55 base pairs (bp) so alondo na 5’cap] (30). Immunoprécipitation ti chromatine (ChIP) afa so tongana a sala kusala na MNA, bungbingo ti Sp1 na zo so ayeke mû maboko na TNFα ayeke gue na li ni fani ota. A zia na yâ ti NFAT nga ye so akono na aga nduru ti ga kota ye (Foto 5B). Asango so afa so MNA ayeke leke yâ ti TNFα na lege ti Sp1, nga na yâ ti mbeni kete ngoi, a yeke leke yâ ti NFAT.
(A) Tongana a haka ni na acellule T so a dü ni sân ti tene a sara kua na MNA, a yeke wara achangement so ayeke si na yâ ti acellule T so a sara kua na MNA. A fa lege ti salango ye na SEM (n = 5 azo so ayeke na nzoni seni). A fa asango so alondo na kamême n = 3 ti a-expérience so ayeke nde. (B) A yeke wara na yâ ti a-cellule T so a sara kua na MNA 8 mM wala so ayeke na ni pëpe na peko ti so a bungbi NFAT na Sp1 na (Ctrl) nga na stimulation ti PMA/ionomycine teti angbonga 4. A yeke wara na yâ ti a-immunoglobuline G (IgG) nga na H3 a-immunoglobuline so ayeke nzoni nga na a-immunoglobuline so ayeke nzoni. Azo so abâ wungo ti ChIP afa so bungbingo ti Sp1 na NFAT na promoteur ti TNFα na yâ ti acellule so a sara kua na MNA ague na li ni fani mingi tongana a haka ni na azo so a mû na ala yorö ni. A fa asango so alondo na kamême n = 3 ti a-expérience so ayeke nde. A yeke wara na yâ ti a-épreuve t mingi (*** P <0,01). (C) Tongana a haka ni na ascite ti HGSC, a-cellule T (so ayeke cytotoxique pëpe) afa so TNF ayeke sigigi mingi na yâ ti tumeur ni. Acolore ni ayeke fä ti azo ti kobela nde nde. A mû a-échantillon ti acellule so a fa ni na lege ti mbana ti si na 300 na a jitter ni ti kanga lege na dessin so ahon ndo ni (** Padj = 0,0076). (D) Modèle ti MNA so a fa ni ndali ti cancer ti ovarium. A yeke wara MNA na yâ ti acellule ti tumeur nga na afibroblaste so ayeke na yâ ti TME na a yeke mû ni na yâ ti acellule T. MNA ayeke sara si Sp1 abungbi na promoteur ti TNFα, na a sara si TNFα ayeke sara kua mingi nga a yeke sara si a-cytokine ti TNFα abâ gigi. MNA ayeke sara nga si IFN-γ adë. Ti kanga lege na kusala ti acellule T ayeke sala si ngangu ti fango zo adë na a yeke sala si tumeur ni akono hio.
Na lege ti ambeni tondo, TNFα ayeke na ngangu ti tiri na a-tumor nga na a-tumor so ayeke na devant nga na peko, me lo yeke na mbeni kusala so azo ahinga ni nzoni mingi ti sara si cancer ti ovarium akono nga ti mû ndo (31-33). Na lege ti ambeni tondo, wungo ti TNFα so ayeke na yâ ti ascite nga na anyama ti tumeur ti azo so ayeke na kobela ti cancer ti ovarium ayeke mingi ahon ti so ayeke na yâ ti anyama so ayeke nzoni pëpe (34-36). Na ndo ti tënë ti sarango kua, TNFα alingbi ti leke yâ ti aglobule blanc so ayeke sara kua, so ayeke sara kua nzoni nga so ayeke kono, nga ti changé mara ti acellule ti cancer ( 37, 38 ). Na lege ti aye so, gingo nda ti ye na ndo ti afango ye ti agene so ayeke nde afa so TNF ayeke na yâ ti acellule T so ayeke na yâ ti anyama ti tumeur tongana a haka ni na ascite (Foto 5C). A yeke gi na yâ ti gbâ ti acellule T so ayeke na mbeni ye so ayeke sara si zo awara kobela pëpe (Foto S5A). Na nduru tënë, asango so amû maboko na bango ndo so atene MNA ayeke na ngangu use ti kanga lege na terê ti zo nga ti sara si a-tumor abâ gigi na yâ ti HGSC.
A-étiquette ti fluorescent so aluti na ndo ti cytométrie ti flux aga kota kode ti mandango ye na ndo ti lege so TIL ayeke sara kua na ni. A-étude so afa so tongana a haka ni na a-lymphocyte ti mênë so ayeke na tere ti zo wala a-cellule T so alondo na yâ ti a-organe ti lymphoïde use, TIL ti murine na ti zo ayeke na kota nzara ti mû glucose (4, 39) nga yeke yeke a-mitochondrie ayeke sara kua nzoni pëpe (19, 40). Atâa so a bâ mara ti ye tongaso na yâ ti étude so, kota ye so a sara ayeke ti haka lege so a-cellule ti tumeur ni ayeke sara kua na ni nga na TIL so alondo na yâ ti oko tissue ti tumeur so a zi ni awe. Ti gue oko na ambeni tënë so a fa kozo awe, a-cellule ti tumeur (CD45-EpCAM +) so alondo na yâ ti ascite nga na a-tumor ayeke mû glucose mingi ahon a-cellule CD8 + na CD4 + T, ye so afa so a lingbi ti haka glucose so a-cellule ti tumeur ayeke mû na a-cellule T. Tënë ti compétition ti acellule T. TME. Me, kusala ti mitochondrie ti acellule ti tumeur ni ayeke ga kota ahon ti acellule CD8 + T, me kusala ti mitochondrie ni ayeke legeoko na ti acellule CD4 + T. Azo so abâ ye so akpengba tënë so ayeke sigigi so atene so métabolisme oxidatif ayeke kota ye mingi ndali ti acellule ti tumeur ( 41, 42 ). Ala tene nga so a-cellule CD8 + T alingbi ti sara si a-oxidation asara kua nzoni ahon a-cellule CD4 + T, wala a-cellule CD4 + T alingbi ti sara kua na ambeni ye nde so ayeke mû carbone na glucose ti bata kusala ti a-mitocondrie ( 43, 44 ). A lingbi ti tene so a bâ pëpe kangbi so ayeke na popo ti mungo glucose wala kusala ti mitochondrie na popo ti a-effecteur CD4 + T, a-effecteur T nga na a-cellule ti mémoire centrale T na yâ ti ascite. Legeoko nga, dutingo ti kangbingo popo ti a-cellule CD8 + T na yâ ti a-tumor ayeke na mbeni ye oko pëpe ti sala na achangement so ayeke si na yâ ti mungo glucose, na ye so afa kota kangbi so ayeke na popo ti a-cellule T so a dü ni na yâ ti a-in vitro na TIL ti zo na yâ ti a-tumor (22). A yeke nga na lege ni ti tene a sara kua na a-automatique ti kangbingo yâ ti acellule so ayeke na mbage ti zo oko pëpe, so afa nga so a-cellule CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + so ayeke mû glucose mingi nga so ayeke sara kua ti mitochondrie ahon a-cellule ti tumeur ayeke mingi me so ayeke na a-cellule so ayeke sara kua nzoni. Azo so alingbi ti duti azo so a tene ala yeke acellule so ayeke kanga lege na myéloïde wala acellule so ayeke plasmacytoïde so a hinga ni na yâ ti gingo nda ti ye so a iri ni scRNA-seq. Atâa so a fa tënë ti aye use so kue na yâ ti a-ovaire ti azo [45], ala ngbâ ti hunda Mbeni kua nde ayeke ti fa nda ti kete wungo ti azo so ayeke na myéloïde so.
Atâa so akode so aluti na ndo ti cytométrie ti flux alingbi ti fa polele kangbi so ayeke na popo ti glucose nga na métabolisme oxidatif na popo ti mara ti acellule nde nde, a hinga pëpe mbilimbili wungo ti amétabolite so glucose wala ambeni ye nde so ayeke mû carbone ayeke sara si a-mitochondrie ayeke sara kua na yâ ti TME. Ti mû wala dutingo pëpe ti amétabolite na mbeni kete wungo ti TIL so a mû ahunda ti tene a sukula wungo ti acellule so ayeke na yâ ti anyama so a zi ni. Tongaso, kode ti e ti lekengo na acellule so abungbi na spectrométrie ti masse alingbi ti mû lege ti hinga ye na ndo ti amétabolite so ayeke na yâ ti acellule T nga na wungo ti acellule ti tumeur na yâ ti a-échantillon ti azo ti kobela so alingbi tere. Atâa so kode so ayeke na aye ti nzoni ahon ti kangbingo yâ ti acellule na lege ti fluorescence, ambeni bibliothèque ti métabolite alingbi ti sara ngangu na ndo ti zo ndali ti so lo yeke ngbâ lakue nzoni nga/wala lo yeke changé hio ( 22 ). Atâa so kue, kode ti e amû lege ti hinga ambeni ye use so a hinga ni nzoni so ayeke sara si terê ti zo akpengba pëpe, adénosine na kynurenine, ndali ti so ala yeke nde nde mingi na popo ti mara ti a-échantillon.
A yeke na lege ni ti tene e hinga ye mingi na ndo ti kua so a-métabolite ayeke sara na yâ ti TME ti a-ovaire. Kozoni, na lege ti cytométrie ti flux, a bâ so kangbi ayeke pëpe na popo ti kusala ti mitochondrie na popo ti a- tumeur na a-cellule CD4 + T. Me, gingo nda ti ye na lege ti LC-MS/MS afa so akota gbiango ye asi na yâ ti wungo ti a-métabolite na popo ti azo so, so afa so a hunda ti tene a fa nda ti atënë so a tene na ndo ti TIL nga na kusala ti lo kue. Use ni, MNA ayeke mbeni ye so ayeke na kota kangbi na popo ti a-CD45-cellule na a-cellule T so ayeke na yâ ti ascite, me pëpe na yâ ti a-tumor. Tongaso, kangbingo yâ ti akota ye nga na ndo so tumeur ni ayeke dä alingbi ti sara ye nde nde na ndo ti sarango ye ti TIL, so afa so a lingbi ti duti nde nde na yâ ti mbeni kete ndo. Ota ni, fango peko ti enzyme so ayeke sara si MNA NNMT ayeke mingi ni na yâ ti CAF, so ayeke acellule ti tumeur na mbeni lege so ayeke kete, me a yeke bâ wungo ti MNA so a lingbi ti hinga ni na yâ ti acellule T so alondo na yâ ti tumeur. Na ngoi so a yeke sara kua na NNMT na yâ ti CAF ti ovarium, a yeke wara mbeni ye so ayeke sara si zo awara cancer, mbeni mbage ni ayeke ndali ti so a yeke sara si CAF ni ayeke sara kua nzoni, a yeke sara si a-tumor ni alï na yâ ti terê ti zo nga a yeke sara si a-ovaire ni akiri aga kota ( 27 ). Atâa so wungo ti azo kue so ayeke na TIL ayeke na popo ti ala, fango peko ti NNMT na yâ ti CAF ayeke ndulu na kete mara ti mésenchyme ti Atlas ti génome ti cancer (TCGA), so ayeke na kamba na asioni ye so ayeke si na zo ( 27, 46, 47 ). Na pekoni, fango na gigi enzyme AOX1 so ayeke sala si MNA abuba ayeke nga gi na yâ ti wungo ti azo ti CAF, so afa so a-cellule T ayeke na ngangu pëpe ti gbian yâ ti MNA. Atondo so amû maboko na tënë so atene atâa so a hunda ti sara ambeni kua nde ti hinga wala ye so a wara so ayeke tâ tënë, tongana MNA ayeke mingi na yâ ti acellule T, a lingbi ti fa so mbeni micro-environnement CAF so ayeke sara si terê ti zo ayeke tiri na akobela ayeke dä.
Na bango kete wungo ti expression ti a-transporteur ti MNA nga na wungo ti akota protéine so ayeke na yâ ti métabolisme ti MNA so zo alingbi ti hinga ni pëpe, a yeke ye so zo aku tere ti lo na ni pëpe ti tene MNA aduti na yâ ti acellule T. A lingbi ti wara pëpe NNMT wala AOX1 na lege ti gingo nda ti ye na lege ti scRNA-seq nga na qPCR so a leke ni nzoni ti agroupe use so ayeke nde. Aye so asi afa so a yeke pëpe acellule T si ayeke sara MNA, me a yeke mû ni na lege ti TME so angoro ni. A-expérience so a sara na yâ ti a-in vitro afa so a-cellule T ayeke sara si a-ADN so ayeke exogène abungbi.
A-étude ti e so e sara na yâ ti a-in vitro afa so MNA so ayeke exogène ayeke sara si TNFα asigigi na yâ ti acellule T nga ayeke sara si Sp1 abungbi na promoteur ti TNFα. Atâa so TNFα ayeke na ngangu ti tiri na a-tumor nga na ti tiri na a-tumor, na yâ ti cancer ti ovarium, TNFα alingbi ti sara si cancer ti ovarium akono (31-33). Ti sara si TNFα aduti na yâ ti culture ti acellule ti tumeur ti ovarien wala ti zi signal ti TNFα na yâ ti a-modèle ti asusu alingbi ti sara si a-cytokine so ayeke sara si zo abâ pasi na lege ti TNFα abâ gigi nzoni nga ti kanga lege na maïngo ti tumeur ni ( 32, 35 ). Tongaso, na yâ ti aye so, MNA so alondo na TME alingbi ti sara kua tongana mbeni ye so ayeke sara si zo abâ pasi na lege ti mbeni ye so abâ lege ti TNFα na lege ti boucle autocrine, na tongaso lo yeke sara si cancer ti ovarium abâ gigi nga lo mû ndo ( 31 ). Na lege ti ye so, a yeke manda ye na ndo ti kangango lege na TNFα tongana mbeni yorö so alingbi ti sava kobela ti cancer ti ovarium ( 37, 48, 49 ). Na ndo ni, MNA ayeke buba yâ ti cytotoxicité ti acellule ti CAR-T na yâ ti acellule ti tumeur ti ovarium, na ye so amû ambeni ye nde ti fa so MNA ayeke kanga lege na tele ti zo ti tiri na kobela. Na bungbingo aye so kue, a fa mbeni tapande so na yâ ni a-tumor na a-cellule ti CAF ayeke sigigi na MNA na yâ ti TME so ayeke na gigi ti acellule. Na lege ti (i) TNF so ayeke sara si cancer ti ovarium akono nga na (ii) MNA so ayeke kanga lege na kusala ti cytotoxique ti acellule T, ye so alingbi ti sara si a-tumor ni aga use (Foto 5D).
Na nda ni, na salango kusala na mbeni bungbi ti salango si acellule aga kota hio, salango kusala na acellule oko oko nga na salango kusala na profil ti métabolisme, gingo nda ti ye so afa kota kangbi so ayeke na popo ti acellule ti tumeur na ti ascite na yâ ti azo ti kobela ti HGSC. Akota gingo nda ti ye so afa so kangbi ayeke na popo ti mungo glucose nga na kusala ti mitochondrie na popo ti acellule T, na a fa so MNA ayeke mbeni ye so ayeke na yâ ti acellule pëpe so ayeke sara si terê ti zo akpengba. Asango so ayeke na ngangu na ndo lege so TME ayeke sala ngangu na ndo salango ye ti acellule T na yâ ti akobela ti cancer ti azo. Atâa so a fa so a yeke tiri mbilimbili ti wara kobe na popo ti a-cellule T na a-cellule ti cancer, a-métabolite alingbi nga ti sala kusala tongana a-régulateur indirect ti mû maboko na guengo na li ni ti tumeur na peut-être ti kanga lege na a-immune so ayeke na yâ ti tele ti zo. Tongana a kiri a fa kusala ti a-métabolite so ayeke leke ye alingbi ti zi lege na ambeni lege nde ti kono yâ ti ngangu ti tele ti zo ti tiri na a-tumor.
A mû a-échantillon ti azo ti kobela nga na asango ti kaïngo kobela na lege ti ndo ti batango anyama ti cancer ti BC so Réseau ti batango anyama ti Canada amû mbeti na ndo ni. Na lege ti protocole so Komite ti salango ye ti azo ti gingo nda ti ye na ndo kobela ti cancer ti BC nga na Université ti Colombie-Britannique (H07-00463) ayeda na ni, a-échantillon kue ti azo ti kobela nga na asango ti da-nganga awara yeda na ni na lege ti mbeti wala ala zia lege ti yeda na ni na lege ti ndia. A bata a-échantillon ni na yâ ti mbeni mbeti so a iri ni BioBank (BRC-00290). A fa anzene nzene ye na ndo ti azo ti kobela na yâ ti atableau S1 na S5. Ti bata ni na yâ ti cryopreservation, a yeke sara kua na mbeni bistouri ti futi na lege ti masini échantillon ti tumeur ti zo ti kobela ni na pekoni a pusu ni na yâ ti mbeni filtre so ayo micron 100 ti wara mbeni cellule oko so ayeke na yâ ti ni. A yeke sala si ascite ti zo ti kobela ni asala centrifuge na 1500 rpm teti penze-ngbonga 10 na 4°C ti sala si acellule ni aga pellet na ti zi ye so ayeke na ndo ni. A bata acellule so a wara na yâ ti tumeur nga na ascite na yâ ti 50% ti sérum ti zo so a sara si wâ asara kua pëpe (Sigma-Aldrich), 40% ti RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) nga na 10% ti diméthyl sulfoxyde. A bata a-suspension ti acellule oko so a bata ni nzoni na a sala kusala na ni teti métabolisme nga na hingango a-métabolite so a fa tënë ni na gbe ni ge.
A yeke wara na yâ ti ni 0,22 μm so a filtré ni 50:50 so a zia na yâ ni RPMI 1640: AimV. 1640 + 2,05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) so a zia na yâ ni 10% ti sérum AB ti zo so asala si wâ asala kusala pëpe (Sigma-Aldrich), 12,5 mM ti Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). A yeke wara na yâ ti ni streptomycine (PenStrep) nga na 50 μMB ti mercaptoéthanol. AimV (Invitrogène) ayeke na Hepes 20 mM (so a leke ni na lege ti fä) nga na l-glutamine 2 mM (so a leke ni na lege ti fä). A yeke wara na yâ ti cytomètre ti flux ni mbeni ngu so a sara ni na phosphate so a filtré ni 0,22μm (PBS; Invitrogen) so a zia na yâ ni 3% ti sérum ti zo AB so a sara si wâ asara kua pëpe (Sigma). A yeke wara na yâ ti tampon ti enrichissement ti acellule ni PBS so a filtré ni 0,22μm na a zia na yâ ni 0,5% ti sérum AB ti zo so a sara si wâ asara kua pëpe (Sigma-Aldrich).
Na yâ ti 37°C, a zia na yâ ti acellule ni 10 nM MT DR nga na 100 μM 2-NBDG teti penze-ngbonga 30. Na pekoni, a zia na yâ ti acellule ni mbeni couleur ti viabilité eF506 na 4°C teti penze-ngbonga 15. A kiri a zia acellule ni na yâ ti FC Block (eBioscience) nga na tampon ti tache brillant (BD Biosciences), a dilué ni na yâ ti tampon ti tache ti cytomètre ti flux (alingbi na afango lege ti zo so asara ni), na a zia ni na yâ ti mbeni ndo so dê ayeke dä pëpe teti penze-ngbonga 10. A yeke wara na yâ ti acellule ni mbeni bungbi ti a-anticorps (Tableau S2) na yâ ti tampon ti coloration ti cytométrie ti flux na 4°C teti penze-ngbonga 20. A yeke nzoni a kiri a zia na yâ ti tampon ti coloration ti cytométrie ti flux (Cytek Aurora; configuration 3L-16V-14B-8R) kozoni si a bâ ni. Lo sara kua na SpectroFlo nga na FlowJo V10 ti bâ wungo ti acellule, na lo sara kua na GraphPad Prism 8 ti sara na asango ni. A yeke wara na yâ ti 2-NBDG na MT DR a-normalisation ti ngangu ti fluorescence médiane (MFI), na pekoni a sara kua na mbeni test t so abungbi use ti sara na analyse ti statistique ti fa wungo ti azo ti kobela so alingbi tere. Zia na yâ ti analyse ni wungo ti azo kue so ayeke na aye so asi na ala ahon 40 pëpe; zia mbeni ngele ti MFI ti 1 teti akete ngele kue so ayeke nzoni pëpe kozoni si mo sala mbeni gingo nda ti ye na ndo ti wungo ti aye nga na bango ndo na ndo ti asango.
Ti tene a mû maboko na e ti sara kua na kode ti sarango kua na maboko ti panneau ti processus so ayeke na nduzu ge, e sara kua na annotation kue so a sû na lege ti keke ti kangango lege na forme (FAUST) (21) ti mû a-automatiquement na a-cellule na azo na peko ti so a zi a-cellule so akui awe na yâ ti FlowJo. A yeke sara kua na maboko ti zo ti bungbi wungo ti azo so mo bâ mo tene a kangbi yâ ti ala na lege ni pëpe (bungbingo PD1+ na acellule ti PD1-tumor) nga na wungo ti azo so a bata ni. Na yâ ti échantillon oko oko, a yeke wara na yâ ti échantillon ni ahon 2% ti acellule, so ti tene wungo ti azo 11 kue.
A sara kua na mbeni ye so a iri ni ficoll ti kangbi popo ti PBMC na a-appareil so ayeke kangbi yâ ti a-leucocyte (STEMCELL Technologies). A zi a-cellule CD8 + T na yâ ti PBMC na lege ti CD8 MicroBeads (Miltenyi) na a kono yâ ni na yâ ti mbeni ye so alingbi kue na lege ti TransAct (Miltenyi) teti ayenga 2 alingbi na afango lege ti azo so asara ni. A zia lege na acellule ni ti luti teti lango 5 na yâ ti mbeni ye so ayeke na IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), na pekoni a kiri a sara si a ngbâ ti sara kua na TransAct. Na lango 7 ni, a lingbi na afango lege ti azo so asala ni, a sala kusala na a-CD45 MicroBeads (Miltenyi) ti zo ti sala si a-cellule ni aga nzoni na yâ ti atour ota so aga na peko ti tele. A mû acellule ni ti sara na analyse ti cytométrie ti débit (tongana ti so a fa ni na nduzu ge), na a mû acellule kutu oko fani ota ti sara na LC-MS/MS. A mû a-échantillon ni na lege ti LC-MS/MS tongana ti so a fa na gbe ni ge. A yeke wara na yâ ti métabolite ni wungo ti a-ion so ayeke 1 000. A yeke sara si a-échantillon oko oko aga normale na lege ti wungo ti a-ion kue (TIC), a yeke changé ni na lege ti logarithme na a yeke sara si a-échantillon ni aga normale automatiquement na yâ ti MetaboAnalystR kozoni si a sara analyse ni.
A zi yâ ti mbeni cellule oko oko ti zo ti kobela oko oko na a zia na yâ ti mbeni filtre so ayo 40 μm ti ga mbeni ye so alingbi kue (tongana ti so a fa ni na nduzu ge). Na lege ti protocole ti azo so asala ni, a sala kusala na atour ota ti nzoni sorongo ye na lege ti kangbingo yâ ti aperle ti magnétique na salango kusala na MicroBeads (Miltenyi) ti sala si a-échantillon ni aga mosoro teti acellule CD8+, CD4+ na CD45- (na ndo glace). Na nduru tënë, a yeke kiri ti zia acellule ni na yâ ti mbeni tampon so ayeke sara si acellule ni aga nzoni (tongana ti so a fa ni na nduzu ge) na a diko wungo ni. A zia na yâ ti acellule ni a-CD8 ti zo, a-CD4 ti zo wala a-CD45 ti zo (Miltenyi) na 4°C teti penze-ngbonga 15, na pekoni a sukula ni na mbeni tampon so ayeke sara si a-cellule ni aga nzoni. A yeke mû échantillon ni na lege ti colonne ti LS (Miltenyi), na a yeke bungbi ambage so ayeke nzoni nga na so ayeke sioni. Ti tene ngoi ni aninga pëpe nga ti tene a sara si a-cellule ni akiri aga nzoni mingi, a yeke mû mbage ti CD8 ni ti sara na use tour ti CD4+ ni, na a yeke mû mbage ti CD4 ni ti sara na CD45 ni na pekoni. Zia solution ni na ndo ti glace na yâ ti ngoi kue so a yeke kangbi yâ ni.
Ti leke a-échantillon ti tene a bâ wala a yeke na yâ ti a-métabolite, a sukula a-cellule ni fani oko na mbeni ngu ti ingo so ayeke glacé, na a zia ml 1 ti méthanol 80% na yâ ti a-échantillon oko oko, na pekoni a sara si a sara vortex na a sara si a ngbâ na yâ ti azote so ayeke ngu. A mû a-échantillon ni na yâ ti a-échantillon ota na a sara si a ngbâ ti ngbâ na yâ ti mbeni centrifuge na 14 000 rpm teti penze-ngbonga 15 na 4°C. A yeke zia ngu so ayeke na yâ ti amétabolite ni na yâ ti ngu juska ahule. A kiri a mû amétabolite ni na yâ ti 50 μl ti acide formique so ayeke 0,03%, a sara si a mélangé ni, na pekoni a sara si a zi asaleté ni.
A yeke wara amétabolite tongana ti so a fa na nduzu ge. A yeke zia na yâ ti mbeni bozo ti chromatographie ti ngu so ayeke sara kua nzoni mingi ti sara na recherche na ndö ti métabolisme. Lo mû mbeni protocole ti kaïngo kobela ti kaïngo kobela ti échantillon oko oko na wungo ti acellule so ayeke legeoko ti kanga lege na asioni ye so ayeke si na yâ ti batch. A sala mbeni gingo nda ti ye na ndo ti aye so ayeke na yâ ti dunia kue so a sigigi na ni kozo awe na ndo ti spectromètre ti masse ti quadrupole ota (50) AB SCIEX QTRAP 5500. A sara kua na logiciel MultiQuant version 2.1 (Appliqué Biosystèmes SCIEX) ti sara na a-analyse ti chromatographie nga na ti bungbingo akota ndo.
A sala kusala na mbeni wungo ti a-ion 1000 ti hinga ngele ti métabolite so amanke, na a sala kusala na TIC ti échantillon oko oko ti diko wungo ti akota ndo ti métabolite oko oko so a wara ni ti leke na achangement so aga na lege ti gingo nda ti ye na lege ti aye ti kusala so alondo na salango kusala na a-échantillon. Na peko ti so a leke TIC awe, a sara kua na MetaboAnalystR(51) (paramètre ti defaut) ti sara si a changé logarithme nga ti sara si a-échelle ti ligne ti norme ni aga automatique. A sala kusala na PCA na vegan R package ti sala na mbeni gingo nda ti ye na ndo kangbi so ayeke na popo ti mara ti a-échantillon, na a sala kusala na mbeni mbage ti redondance ti gi nda ti azo ti kobela. Lo sara kua na kode ti Ward ti leke na mbeni dendrogramme ti carte ti chaleur ti bungbi yongo ti Euclide na popo ti a-échantillon. A sala kusala na limma (52) na ndo wungo ti amétabolite so a leke ni nzoni ti hinga wungo ti amétabolite so ayeke nde na yâ mara ti acellule kue nga na yâ akete kodoro. Ti tene a sara si fango nda ti ye ni aga ngangu pëpe, a sara kua na paramètre ti moyenne ti groupe ti fa na model ni, na a bâ mara ti acellule so ayeke na yâ ti micro-environnement ni tongana groupe oko oko (n = groupe 6); ti tara ti bâ wala a yeke kota ye, a sara amesure ota fani mingi ndali ti métabolite oko oko Ti tene a sara si a kiri pekoni na lege ti wataka pëpe, a zia zo ti kobela ni tongana mbeni ye so ayeke kanga lege na lo ti sara limma ni. Ti bâ kangbi so ayeke na yâ ti a-métabolite so ayeke na popo ti azo ti kobela nde nde, a leke yâ ti model ti limma so andu azo ti kobela na mbeni lege so a leke ni nzoni. A fa kota ti kangbi so a fa kozoni awe na popo ti mara ti acellule na akete ye so ayeke na yâ ti Padj <0,05 (correction ti Benjamini-Hochberg).
Na peko ti so a mû ngangu na lo na lege ti Kit ti zingo na acellule so akui awe ti Miltenyi (>80% ti fini), a sara mbeni séquencement ti transcriptome ti mbeni cellule oko na ndo ti a-échantillon ti ascite nga na ti tumeur so a sara ni na glace kue so ayeke na fini na lege ti mbeni protocole ti fango na gigi 10x 5′gene. A gi nda ti azo oku so ayeke na a-tumor nga na ascite so alingbi tele, atâa so kete wungo ti azo so alingbi ti ngbâ na fini so alondo na mbeni échantillon ti tumeur akanga lege na ala ti zia ni na yâ ni. Ti tene a soro azo ti kobela mingi, a bungbi a-échantillon ti azo ti kobela oko oko na yâ ti alege ti 10x chromium controller, na a bâ ndo na ndo ti ascite nga na ndo ti tumeur ni nde nde. Na peko ti so a sara kua na séquence [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp ti yanga ti kodoro use (PE), génome ti Québec; a yeke na lege ni ti tene e sara kua na CellSNP nga na Vireo (53) (so aluti na ndö ti CellSNP tongana SNP ti azo kue (VCF) so GRCh38 amû na lo (genotype ti zo ti kobela so ayeke na yâ ti cloBS’s) (IBS), so a zia na gigi acellule so a mû na ala pëpe nga na acellule so a hinga ni tongana a-échantillon ti ascite na ti tumeur (54), a bata a-affaire ota so ayeke na gbâ ti a-échantillon ti a-tumeur nga na a-ascite ti tene a sara mbeni étape ti filtration ti masse ( scCoran pa5) . a mû na ala acellule 6975 (acellule 2792 na 4183 so alondo na tumeur nga na ascite, na lege ti mbaï) A sara kua na igraph (57) Louvain so abungbi acellule so ayeke nduru mingi (SNN) so aluti na ndo ti yongo ti Jaccard ti bungbi acellule na lege ti expression so a sara ni na maboko. na a bâ ni na lege ti t-SNE, a yeke fa nda ti a-cellule T so ayeke na yâ ti CD8A na GZMA, so a zi na yâ ni akete bungbi so ayeke na kete wungo ti protéine ti ribosome A wara asango so a sigigi na ni na yâ ti mbeti ti Izar et al (16), so na popo ni a yeke wara t-SNE so a zia na yâ ti cellule ti ala.
A kangbi yâ ti PBMC na a-appareil so ayeke kangbi yâ ti a-électrode ti mênë (STEMCELL Technologies) na lege ti mbeni ye so a iri ni Ficoll. A zi a-cellule CD3 + na yâ ti PBMC na lege ti a-perle ti CD3 (Miltenyi). Na yâ ti MNA wala pëpe, a yeke sara si a-CD3+ so ayeke na yâ ti aplaque ni ayeke sara kua nzoni (5 μg/ml), CD28 so ayeke na yâ ti ngu (3 μg/ml) nga na IL-2 (300 U/ml; Proléucine). Na ndangba lango ti konongo ni, a bâ wala a lingbi ti ngbâ na fini (Dye ti Viability Fixable eFluor450, eBioscience) nga na lege so a lingbi ti kono na ni (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) na lege ti cytométrie ti flux. A yeke na lege ni ti tene e sara kua na PMA (20 ng/ml) nga na ionomycine (1μg/ml) na lege ti GolgiStop teti angbonga 4, na e bâ lege ti CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) nga na TNForethictein . (Mb11, BD). A yeke wara na yâ ti qPCR nga na ChIP PMA (20 ng/ml) nga na ionomycine (1μg/ml) teti angbonga 4. A mû ngu ti ELISA kozoni na peko ti so a mû na lo PMA (20 ng/ml) nga na ionomycine (1 μg/ml) teti angbonga 4.
Sara ye alingbi na awango ti azo so asara ni ti zi ARN na lege ti mbeni kete ye so a iri ni RNeasy Plus (QIAGEN). Lo sara kua na QIAGEN (QIAGEN) ti sara si a-échantillon ni aga oko. Lo sara kua na kit ti ARN ti ADN so ayeke na ngangu mingi (Thermo Fisher Scientific) ti leke na ADN so ayeke mû maboko na zo (ADN). Lo sara kua na TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ti hinga wungo ti agene so ayeke na yâ ti tere ti zo (na lege ti protocole ti azo so asara ni) na lege ti a-appareil so: A yeke wara na yâ ti ambeti ti e ambeni ye so a iri ni glycéraldéhyde-3-phosphate à l’hydrogène (GAPDH) nga na mbeni ye so a iri ni glycéraldéhyde-3-phosphate. A mû a-échantillon ni na lege ti système ti PCR ti StepOnePlus (Biosystèmes appliqués) (Biosystèmes appliqués) na yâ ti plaque ti réaction optique rapide ti MicroAmp so ayeke na adû 96 (Biosystèmes appliqués) so ayeke na film optique ti MicroAmp. A yeke bâ wungo ti Ct kue so ahon 35 tongana mbeni ye so ayeke na ndo ti wungo ti aye so a lingbi ti hinga ni na a zia marque na ndo ni so a lingbi ti hinga ni pëpe.
Sara ChIP tongana ti so a fa ni kozo awe (58). Na nduru tënë, a mû na acellule ni formaldéhyde (so wungo ni ayeke 1,42%) na a zia ni na yâ ti chambre teti penze-ngbonga 10. Lo mû na lo mbeni ye so a iri ni tampon ti gonflement (Hepes 25 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 10 mM nga na NP-40 0,1%) na ndo ti glace teti penze-ngbonga 10, na pekoni lo kiri lo zia ni na yâ ti tampon ti immunoprécipitation tongana ti so a fa ni (58). Na pekoni, a sala si échantillon ni asala kusala na a-échantillon so: a-échantillon 10 (a-pulse 20 ti seconde 1) nga na mbeni ngoi so ayeke ngbâ gi tongaso ti seconde 40. A yeke wara na yâ ti échantillon ni a-anticorps ti immunoglobuline G (technologie ti fango lege na acellule; 1μl), histone H3 (technologie ti fango lege na acellule; 3μl), NFAT (Invitrogène; 3μl) nga na SP1 (technologie ti fango lege na acellule; 3μl). A yeke zia na yâ ti échantillon ni akete perle ti protéine A (Thermo Fisher Scientific) na 4°C na a yeke yengi ni kete teti ngbonga 1, na pekoni a yeke sara kua na aperle ti chelex (Bio-Rad) ti sara si ADN ni aga nzoni, nga a yeke sara kua na protéine K (Thermo Fisher) ti sara si a-échantillon ni aga nzoni. A yeke wara na yâ ti PCR ni mbeni promoteur ti TNFα: na devant, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; na mbage, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produit so ayeke na 207 bp). A yeke Image Lab (Bio-Rad) la asara a-image ni na a diko wungo ni na lege ti logiciel ImageJ.
A bungbi a-surnatant ti culture ti acellule ni tongana ti so a fa na nduzu ge. A leke ni alingbi na akode ti azo so aleke a-étude ti TNFα ti zo (Invitrogen), a-étude ti IL-2 ti zo (Invitrogen) nga na a-étude ti IFN-γ ti zo (Abcam). Na lege ti protocole ti azo so aleke ni, a yeke dilué ngu so ayeke na ndo ti ngu ni 1:100 ti hinga TNFα na IL-2, nga 1:3 ti hinga IFN-γ. Lo sara kua na mbeni ye so a iri ni EnVision 2104 (PerkinElmer) ti mû mesure ti absorption so ayeke na 450 nm.
A kangbi yâ ti PBMC na a-appareil so ayeke kangbi yâ ti a-électrode ti mênë (STEMCELL Technologies) na lege ti mbeni ye so a iri ni Ficoll. A zi a-cellule CD3 + na yâ ti PBMC na lege ti a-perle ti CD3 (Miltenyi). Na yâ ti MNA wala pëpe, a yeke sara si a-CD3+ so ayeke na yâ ti aplaque ni ayeke sara kua nzoni (5μg/ml), CD28 so ayeke na yâ ti ngu (3μg/ml) nga na IL-2 (300 U/ml; Proléucine) teti lango ota. Na peko ti lango ota, a bungbi acellule ni na a sukula ni na ngu ti ingo so ayeke na 0,9%, na a zia pellet ni na yâ ti glace. A diko wungo ti acellule na lege ti cytométrie ti flux (Cytek Aurora; lekengo ye 3L-16V-14B-8R) na salango kusala na a-eBeads so wungo ni ayeke 123.
A yeke wara amétabolite tongana ti so a fa na nduzu ge. A kiri a leke yâ ti ngu ni na mbeni wungo ti acellule 4000/μl. A yeke wara na yâ ti a-échantillon ni mbeni ye so a iri ni chromatographie inverse (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, Californie) nga na mbeni colonne ti CORTECS T3 (2,1×150 mm, kota ti akete kete ye ni ayeke 1,6-μm, kota ti aporo ni ayeke 120-Å; #186008500). A yeke wara na yâ ti ni mbeni spectromètre ti masse polaire (6470, Agilent), so na yâ ni a yeke sara kua na a-ion so ayeke sara kua na électrospray. Phase mobile A ayeke 0,1% ti acide formique (na yâ ti H2O), phase mobile B ayeke 90% ti acétonitrile, 0,1% ti acide formique. Na pekoni, a kiri a leke colonne ni na phase mobile A na mbeni débit ti 0,6 ml/min teti penze-ngbonga 3. . A yeke 0,4ml/min, na a yeke sara si chambre ti colonne ni aga chaud juska na 50°C. Lo sara kua na mbeni ye so ayeke na yâ ti MNA (M320995, Société chimique de recherche de Toronto, North York, Ontario, Canada) ti fa ngoi ti batango ye (RT) nga na ti gbiango ye (RT = penze-ngbonga 0,882, gbiango ye 1 = 137→94,1, gbiango ye 2 = 137, gbiango ye→373). Tongana a-transition ota so kue asi na ngoi ti batango ye so alingbi, a yeke sala kusala na a-transition 1 teti wungo ti aye ti tene a duti mbilimbili. A leke courbe ti standard ti MNA (Société chimique ti recherche ti Toronto) na lege ti dilution omene ti série ti solution ti stock (1 mg/ml) ti wara a-étalon ti 0,1, 1,0, 10 na 100 ng/ml nga na 1,0 na 10μg/ml ti ngu. A yeke wara na yâ ti ni 1 ng/ml, na a yeke wara na yâ ti ligne ni 10 ng/ml na 10μg/ml. A yeke mû na yâ ti injection oko oko ti microlitre use ti échantillon nga na standard ti sara na analyse ti LC/MS, na a yeke sara kua na mbeni échantillon ti bango lege ti nzoni ti aye so abungbi na yâ ti a-injection osio oko oko ti tene a ngbâ nzoni na ndo ti plateforme ti analyse ni. Akiringo tënë ti MNA ti a-échantillon ti acellule kue so a sala kusala na MNA ayeke na yâ ti ligne ti assay ni. A sara kua na logiciel ti gingo nda ti ye so a iri ni MassHunter (v9.0, Agilent).
A mû use generation ti αFR-CAR so a leke ni na Song et al. (59). Na nduru tënë, a leke yâ ti aye so: molongo ti akota zo ti CD8a, mbeni mbage ti chaîne oko so ayeke changé changengo so ayeke nde na αFR ti zo, charnière ti CD8a nga na ndo so ayeke na yâ ti membrane, domaine intracellulaire ti CD27 nga na domaine intracellulaire ti CD3z. A leke molongo ti CAR ni kue na lege ti GenScript, na pekoni a cloné ni na yâ ti vecteur ti fango tënë ti lentivirus ti use génération so ayeke na nduzu na ndo ti cassette ti fango tënë ti GFP so a sara kua na ni ti bâ wala a yeke sara kua nzoni.
A yeke wara lentivirus na lege ti ziango na yâ ti acellule ti HEK293T [Bungbi ti mara ti azo ti Amerika (ATCC); a leke ni na yâ ti mbeni ye so a leke ni na lege ti Dulbecco so ayeke na 10% ti mênë ti ngombe (FBS) nga na 1% ti PenStrep, na a sara kua na vecteur CAR-GFP nga na a-plasmide so ayeke na yâ ti bozo ni (psPAX2 na pMD2.G, Addgene) so ayeke sara kua na a-amine so ayeke sara si mafuta ti tere ti zo aga nzoni (Sigma-Aldrich). A bungbi ngu so ayeke na yâ ti virus ni ngbonga 48 na 72 na peko ti so a zia na yâ ti ni, a filtré ni na a bungbi ni na lege ti ultracentrifugation. A bata ngu ti virus so abungbi na -80°C juska a sara transduction.
A kangbi yâ ti PBMC na a-appareil ti kangbingo yâ ti a-électron so ayeke na nzoni seni (STEMCELL Technologies) na lege ti mbeni ye so a iri ni Ficoll. Lo sara kua na akete perle ti CD8 (Miltenyi) so ayeke na nzoni sorongo ye ti kangbi yâ ti acellule CD8+ na yâ ti PBMC. A yeke sara si a-cellule T ayeke sara kua na TransAct (Miltenyi) nga na yâ ti mbeni ye so a iri ni TexMACS [Miltenyi; a mû na lo 3% ti mênë ti zo so a sara si wâ asara kua pëpe, 1% ti PenStrep nga na IL-2 (300 U/ml)]. Angbonga 24 na peko ti so a zia na yâ ti acellule T ni mbeni ye so a iri ni lentivirus (10 μl ti supernatant ti virus so abungbi na yâ ti acellule 106). 1 ti si na lango 3 na peko ti so a zia na yâ ti Cytek Aurora (na ndo ti FSC (Séparcement avant)/SSC (Séparceur côté), Singlet, GFP+), a bâ lege so GFP ayeke fa na yâ ti acellule ni ti fa so a yeke sara kua nzoni na 30% .
A zia a-cellule ti CAR-T na yâ ti angbonga 24 na yâ ti Immunocult (STEMCELL Technologies; a zia na yâ ni 1% ti PenStrep) na yâ ti aye so: a sara kua na ni pëpe, a sara kua na 250 μM ti adénosine wala 10 mM ti MNA. Na peko ti so a sara kua na ni kozo awe, a sukula a-cellule ti CAR-T na PBS na a bungbi ni na a-cellule 20 000 ti SK-OV-3 [ATCC; na yâ ti ngu ti McCoy 5A (Sigma-Aldrich) so a zia na yâ ni 10% ti FBS nga na 1% ti PenStrep na 10: A sara si wungo ti azo so ayeke sara kua na 1 aga kota na yâ ti ngu ti Immunocult so a zia na yâ ni. A yeke wara na yâ ti a-étude ni ambeni ye so a iri ni saponine digitalis (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich). Na peko ti so a sara ngbonga 24 ti sara kua maboko na maboko, a bungbi ngu so ayeke na ndo ti ngu ni na a mû mesure ti lactate déhydrogénase (LDH) so alingbi na afango lege ti azo so asara ni (Kit ti test ti cytotoxicité ti LDH Glo, Promega). A yeke zia na yâ ti tampon ti LDH 1:50 ngu so ayeke na ndo ti LDH. A mû wungo ti azo so a fâ ala na lege ti formule so: wungo ti azo so a fâ ala = wungo ti azo so a leke ala / wungo ti azo so a fâ ala x 100%, ndo so wungo ti azo so a fâ ala = co-culture-T cellules gi, na wungo ti azo so a fâ ala = contrôle positif-contrôle négatif.
Tongana ti so a fa na yâ ti mbeti wala na yâ ti aye nga na akode ti sarango na kua, sara kua na GraphPad Prism 8, Microsoft Excel wala R v3.6.0 ti sara na étude ti wungo ti azo. Tongana a mû a-échantillon mingi na mbage ti mbeni zo ti kobela oko (tongana ascite na tumeur), a yeke sara kua na mbeni test t so abungbi wala a yeke zia zo ti kobela ni tongana mbeni ye so asi gi tongaso na yâ ti mbeni model ligne wala généralisé tongana alingbi. Ti gi nda ti ye na ndo ti métabolisme, a yeke sara test ti kota ye ni na yâ ti ambeti ota.
Ti wara ambeni ye nde ti sara na article so, bâ ndo na ndo ti site ti e.
A yeke mbeni article so azo kue alingbi ti wara ni so a kangbi ni na gbe ti andia ti Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, so amû lege ti sara kua na ni, ti kangbi ni nga ti kiri ti sara ni na mbeni lege nde, gi tongana ndangba kusala ni ayeke pëpe ti wara na nginza nga so ye so a fa ayeke so kozo mbeti ni ayeke na lege ni. Zo ti ba.
Note: E hunda gi na mo ti mû adresse e-mail ti mo tongaso si zo so mo recommandé lo na ndö ti page ni ahinga so mo ye ti tene lo bâ e-mail ni nga so a yeke spam ape. A yeke mû ande pëpe adresse ti e-mail.
A yeke sara kua na hundango ndo so ti tara wala mo yeke mbeni vizite nga ti kanga lege na tokuango asango ti spam automatiquement.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (Russell G. Jones), Phinéas T.
MNA ayeke mû maboko ti kanga lege na a-immunothérapie ti a-cellule T nga a yeke mbeni ye so alingbi ti mû maboko na zo ti sava kobela ti cancer ti zo.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (Russell G. Jones), Phinéas T.
MNA ayeke mû maboko ti kanga lege na a-immunothérapie ti a-cellule T nga a yeke mbeni ye so alingbi ti mû maboko na zo ti sava kobela ti cancer ti zo.
©2021 Bungbi ti Amerika ti guengo na li ni ti senda-ye. a yeke bata droit kue. AAAS ayeke mbeni mba ti HINARI, AGORA, OARE, CHORALE, CLOCKSS, CrossRef na COMPTEUR. ISSN 2375-2548 ti senda-ye.