Ti kangbi yâ ti aprotéine na yâ ti lege so a yeke sigigi na ni ayeke kota ye mingi ti tene a-cellule angbâ ti kangbi yâ ti terê ti ala nga ti tene a-homéostase aduti nzoni. Na ndo ti sorongo ye na lege ti coquillage, kusala ti a-lipide na yâ ti sorongo ye na lege ti kinesine na yâ ti kusala ti kangbingo ye na yâ ti mênë ayeke mbeni kota hundango ndo so aninga awe na so ade a kiri tënë na ni pëpe. Na ndo so, a yeke sara kua na a-image ti 3D so ayeke na akota couleur mingi ti fa na yâ ti gigi ti zo so afini protéine so a leke ni na glycosylphosphatidylinositol so ayeke na akota mbage ti lipidi ti céramide so ayeke yongoro mingi abungbi na a kangbi yâ ni na yâ ti a-endoplasme so ayeke nde na lege ti site ti sigingo ti transmbrane, so ayeke. Na ndo ni, a fa so yongo ti chaîne ti céramide so ayeke na yâ ti membrane ti réticulum endoplasmique ayeke kota ye mingi ndali ti sorongo ye so. Na yâ ti étude ti e, a mû kozo ye so afa so a lingbi a kangbi yâ ti acargo ti protéine so aluti na ndo ti yongo ti chaîne ti lipidi na yâ ti ambeni ndo so a soro ni ti tokua ni na gigi na yâ ti lege ti secretoire.
Na yâ ti acellule ti eucaryote, a yeke soro aprotéine so a leke ni na yâ ti réticulum endoplasmique (ER) na ngoi so a yeke gue na ni na lege ti secrétion ti tene a gue na ni na ndo so alingbi na cellule ni (1). Na ndo ti sorongo ye na lege ti couche, a tene ngbene ye giriri so ambeni lipidi alingbi nga ti sara kua tongana a-outil so a soro ni na lege so a bungbi ala na yâ ti ambeni mbilimbili domaine ti membrane so ayeke ambeni mbilimbili protéine (2-5). Ye oko, a ngbâ ti wara pëpe mbeni ye so afa biani so ye so ayeke na yâ ti tere ti zo alingbi ti si na lege ti lipidi. Ti leke kota kpale so, a manda na yâ ti levure tongana nyen la a yeke sara si a-ancré ti glycosylphosphatidylinositol (GPI) (GPI-AP) alondo na yâ ti ER. GPI-AP ayeke mara ti aprotéine nde nde so ayeke na yâ ti acellule so ayeke na lipidi ( 6, 7 ). GPI-AP ayeke mbeni protéine so alondo na yâ ti mênë ti zo na lege ti mbage ti glycolipide (ancre ti GPI). Ala yeda na a-ancre ti GPI tongana a-ancre ti peko ti traduction so ayeke na yâ ti lumière ti ER (8). Na peko ti so a zia ni na yâ ni, GPI-AP ayeke hon na yâ ti appareil ti Golgi (5, 9) so alondo na ER ti si na yâ ti membrane ti plasma. Ti wara a-ancre ti GPI asara si a yeke gue na GPI-AP nde na a-protéine so ayeke sigigi na yâ ti a-transmembrane (so na popo ni a yeke wara ambeni protéine so ayeke na yâ ti membrane ti plasma) na ndo ti lege so a-protéine ayeke sigigi na ni (5, 9, 10). Na yâ ti acellule ti levure, a yeke kangbi yâ ti a-GPI-AP na ambeni protéine so a sigigi na ni na yâ ti réticulum endoplasmique, na pekoni a yeke bungbi ni na yâ ti ambeni vésicule so ayeke nde so a kanga ni na mbeni protéine ti couche complexe II (COPII) (6, 7). Azo so ayeke sara kua na yâ ti kapa ti kangbingo yâ ti aye so ayeke na yâ ti ER ayeke polele pëpe, me a tene so kode so alingbi ti hunda ti tene a mû a-lipide, mbilimbili ti leke yâ ti mbage ti a-lipide ti ancre ti GPI (5, 8). Na yâ ti levure, a yeke to nda ti leke yâ ti a-lipide ti GPI hio na peko ti so GPI ni abungbi, na mingi ni, a yeke sara si ceramide ni abungbi na acide gras saturé à long chaîne so ayeke na carbone 26 (C26:0) (11, 12). C26 ceramide ayeke kota ceramide so a-cellule ti levure ayeke sara juska fadeso. A yeke sara ni na yâ ti ER na mingi ti aye ni ayeke gue na yâ ti appareil ti Golgi na lege ti a-vésicule ti COPII (13). ER ti tokua na gigi ti GPI-AP ahunda mbilimbili ti tene a ngbâ lakue ti leke a-céramide (14, 15), na pekoni, gbiango a-céramide ti ga céramide ti inositol phosphate (IPC) na yâ ti appareil ti Golgi aluti na ndo ti lekengo a-ancre ti GPI (16). Azo so asara étude na ndö ti biophysique na ndö ti a-artificiel afa so a-céramide so ayeke na chaîne acyl so ayo mingi alingbi ti bungbi oko ti sara ambeni domaine so ayeke na ordre so ayeke na ambeni ye so ayeke nde ( 17, 18 ). Asango so ague na zo ti pensé so C26 ceramide na GPI-AP na C26 ceramide asara kua na a-appareil ti ala ti bungbi oko ti ga arégion so ayeke na lege ni wala arégion so ayeke na yâ ti a-lipide ti membrane ti ER so ayeke na yâ ti wusuwusu. A yeke wara na yâ ni mingi ni akete glycérolipide so ayeke na ngu pëpe (C16:1 na C18:1) (19, 20). A yeke soro ande arégion so ti bâ ambeni mbilimbili ndo ti sigingo ti ER (ERES), ndo so a lingbi ti mû ceramide na GPI-AP so ayeke na ceramide ti gue na ni na Golgi na yâ ti oko vésicule ti COPII so a mû ni nde (5).
Na yâ ti étude so, a tara directement kode so aluti na ndo ti lipidi so na lege ti microscope ti bango na image na ngoi ti tâ tënë (SCLIM), so ayeke mbeni kode ti bango na aye so ayeke na lege ni mingi so alingbi ti bâ na oko ngoi ni aprotéine so a zia marque na ndo ni na lege ti fluorescence (21, 22).
A yeke kozoni ti tene a sara kua na kode ti SCLIM ti fa ye mingi na ndo ti lege so a yeke sara kua na GPI-AP so ayeke na lege ni na groupe ti ceramide C26 ti bâ na lege ti aprotéine so alondo na yâ ti membrane na peko ti so a zia ER na yâ ti S. cerevisiae. Ti bâ lege so a kangbi yâ ti ER, a sara kua na mbeni système génétique so alingbi ti bâ na lê ti zo afini cargo so a leke ni so ayeke lï na yâ ti ERES in vivo (7, 23). Na yâ ti cargo ni, a soro GPI-AP Gas1 so a sara ni na céramide ti C26 so a sû iri ti lo na ndo ti mbeni protéine so ayeke za na yâ ti mênë (GFP) nga na mbeni protéine so ayeke sigigi na yâ ti membrane Mid2 so a zia iri ti lo na ndo ti mbeni protéine so ayeke za na yâ ti plasma (iRFP), so ala use kue ayeke sara kua na ndo ti membrane ti plasma (24–26). Na yâ ti sec31-1 so ayeke na yâ ti mutant ni, a yeke fa acargo use so na gbe ti mbeni promoteur so ayeke sara si galactose abâ gigi nga na mbeni marqueur ti ERES so ayeke sara si zo abâ gigi. Na ngoi so ndowa ayeke ngangu mingi (37°C), ndali ti so mutation ti sec31-1 asara ngangu na ndo ti kua ti COPII so ayeke na yâ ti couche Sec31 ti kanga lege na COPII ti sigigi na ti sigigi na ER, afini cargo so a leke ni ayeke bungbi na ER (23). Na peko ti so a sara si ndowa ni aga kete (24°C), a-cellule so achangé sec31-1 ni akiri na yâ ti ndo so a yeke sigigi na ni, na afini cargo ti synthèse so abungbi akomanse ti sigigi na yâ ti ER ni. CLIM afa so mingi ti afini Gas1-GFP na Mid2-iRFP so a leke ni angbâ ti bungbi na yâ ti ER ti acellule ti sec31-1 so achangé na peko ti so a zia ni na 37°C na pekoni a zi ni na 24°C teti penze-ngbonga 5 (Foto 1). Teti so Mid2-iRFP ayeke kangbi na ndo ti membrane ti ER kue, na Gas1-GFP ayeke bungbi na ndo ti membrane ti ER so ayeke na lege ni pëpe, kangbingo yâ ti ala ayeke nde mingi (Foto 1, A ti si na C nga na Film S1). Na ndo ni, tongana ti so a fa na yâ ti tableau 1D, bungbi ti Gas1-GFP ayeke na Mid2-iRFP pëpe. Azo so abâ ni afa so a kangbi yâ ti GPI-AP nga na aprotéine so ayeke na yâ ti membrane ti ER na yâ ti ambage nde nde ti membrane ti ER. Abungbi ti Gas1-GFP ayeke na tele ti mbeni mbilimbili ERES so a sû iri ti lo na ndo ni na protéine ti couche ti mCherry so ayeke COPII Sec13 (Foto 1, E na F, na film S1) (23).
1-1-GFP (GPI-AP, vert) nga na mbeni protéine so ayeke na yâ ti membrane ti Mid2-iRFP (TMP, bleu) nga na mbeni ye so a iri ni constructive ERES marquage Sec13-mCherry, 30) penze-ngbonga 5, a gue na ni na 24°C, na a mû image ni na SCLIM penze-ngbonga 5 na pekoni. (A ti si na C) afa mbeni image 2D so abungbi wala so ayeke gi oko ti mbeni plan (A), mbeni image ti projection 2D ti a-z-section 10 (B) wala mbeni image ti hémisphère ti acellule 3D ti cargo nga na a-marqueur ti ERES (C). Barre ti échelle ni ayeke 1μm (A na B). A yeke wara na yâ ti échelle ni 0,551μm (C). A yeke wara Gas1-GFP na yâ ti arégion wala agroupe ti ER so ayeke nde, na a yeke wara Mid2-iRFP na a kangbi ni na yâ ti membrane ti ER kue (C). (D) Graphique ni afa ngangu ti fluorescence ti Gas1-GFP na Mid2-iRFP so ayeke na yâ ti groupe ti Gas1-GFP so ayeke na ndo ti vuru flèche (na mbage ti koli). AU, unité ti arbitraire. (E na F) afa image ti 3D so abungbi abongo ni na marque ti ERES. A yeke wara abungbi ti Gas1-GFP so ayeke na tele ti mbilimbili ERES. A yeke wara na yâ ti échelle ni 0,551μm. (F) Flèche so ayeke vuru so ayeke ngangu mingi afa bungbi ti Gas1-GFP so abungbi na ERES. A-panneau so ayeke na popo ni nga na mbage ti koli afa image 3D so akono so a bungbi ni nga na mbeni bango ndo so a tourné ni na ndo ti groupe ti Gas1-GFP so a soro ni.
Akota songo so ayeke na popo ti bungbi ti Gas1-GFP na mbeni mbilimbili ERES afa so Gas1-GFP alingbi ti lï na yâ ti ERES so a soro ni, so ayeke nde na sorongo ye so Mid2-iRFP ayeke sara kua na ni ti sigigi na yâ ti ER ni. Ti leke kpale so, a diko wungo ti ERES gi teti mbeni ye oko wala use (Foto 2, A ti si na C). A bâ so mingi ti a-ERES (70%) ayeke gi na mara ti akungba oko. Image ti gbe ti tableau 2C afa atapande use ti ERES so ayeke gi na Gas1-GFP (fä 1) wala gi Mid2-iRFP (fä 2). Nde na so, ndulu na 20% ti ERES ayeke na acargo use so abungbi tele na ndo oko. A bâ so ambeni ERES (10%) ayeke na mara ti akungba use, me a zia ala nde na ando so ayeke nde polele. Tongaso, gingo nda ti ye so afa so na peko ti so a sigigi na ER, a kangbi yâ ti GPI-AP Gas1-GFP nga na cargo ti transmembrane Mid2-iRFP na yâ ti a-ERES nde nde (Foto 2D). A yeke nzoni ti soro aye so ague oko mingi na aye so a sara kozo awe na lege ti biochimie (6) nga na aye so a fa na lege ti morphologie (7). A lingbi nga ti ba salango ye ti a cargo ti quarantaine so ayeke lï na yâ ERES (Foto 2E na Film S2). Figure 2E afa so gi mbeni kete mbage ti Gas1-GFP (panneau 3) wala Mid2-iRFP (panneau 4) la ayeke lï na yâ ti ERES na mbage oko na a kanga ni na yâ ti mbeni ndo so ayeke nde. Panneau 5 ti tableau 2E afa so Gas1-GFP na Mid2-iRFP ayeke na ambeni ngoi na yâ ti oko ERES, me ala yeke lï na mbage nde nde na ala yeke bungbi na yâ ti ando nde nde so alingbi ti fa a-vésicule ti COPII nde nde. A fa nga so kangbingo popo ti aye so a bâ nga na kangbingo yâ ti GPI-AP Gas1 so a leke ni na ceramide ti C26 tongana ERES so a soro ni ayeke mbilimbili ndali ti so mbeni charge ti secrétion ti transmembrane nde, so ayeke protéine ti membrane ti plasma so a zia marque na ndo ni na GFP Axl2 (27 ), afa mara ti sarango ye tongaso na Mid2-iRFP. (Foto S1 na Film S3). Afini Axl2-GFP so a leke ni ayeke kangbi yâ ti membrane ti ER tongana Mid2-iRFP (Foto S1, A na B), na a yeke wara ni legeoko na Mid2-iRFP na yâ ti mingi ti a-ERES (Foto S1, B ti si na D). Panneau 1 na 2 ti tableau 1. S1C afa atapande use ti ERES so na yâ ni acargo use ti transmembrane ayeke tingbi tele. Na yâ ti aye so, abongo use so kue ayeke lï na yâ ti ERES legeoko (Foto S1E, Panneau 3 na Film S3).
Na peko ti so a zia na yâ ti a-incubation ti galactose so ayeke sara si galactose alondo, Gas1-GFP (GPI-AP, vert) nga na Mid2-iRFP (TMP, bleu) nga na a-étiquette ti ERES so ayeke sara si a-étiquette ti Sec13-mCherry (ERES, magenta) abâ gigi na 37 Na peko ti so a zia na yâ ti a-incubation ni na °C ti si na 30 °C. bloc, na image na SCLIM na peko ti penze-ngbonga 20. (A ti si na C) A-image ti fango na gigi 2D (A; barre ti échelle, 1μm) wala a-image ti hémisphère ti acellule 3D (B na C; unité ti échelle, 0,456μm) ti cargo ni nga na a-z-section 10 so a zia marque na ndo ni na lege ti ERES. Panneau ti gbe ni na (B) nga na panneau ti (C) afa a-image so a leke ni ti fa gi abongo so ayeke na yâ ti ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) na Mid2-iRFP (bleu clair)]. (C) Flèche so a zi ni: ERES ayeke yô gi mbeni ye oko (1 ti si na 4). Flèche ti gris: ERES ayeke na acargo so a kangbi yâ ni (5). Flèche so akpengba mingi: ERES so ayeke na yâ ni acargo so ayeke na ndo oko. Na gbe ni ge: ERES oko so a soro ni ayeke gi na Gas1-GFP (1) wala Mid2-iRFP (2). Barre ti échelle, 100 nm. (D) Wungo ti fotomicrographe so a fa tënë ni na (C). A yeke wara na yâ ti ERES ni gi mbeni ye oko (Gas1-GFP wala Mid2-iRFP), aye so a kangbi yâ ni nga na aye so abungbi. Na yâ ti a-expérience ota so azo asara, n=432 na yâ ti acellule 54. Barre ti erreur = SD. Test ti t so ayeke na couple pëpe. *** P = 0,0002. (E) Image 3D ti ERES so a soro ni ti zia na yâ ti quarantaine so a zia marque na ndo ni (C). Gas1-GFP (vert) (3) wala Mid2-iRFP (bleu) (4) ayeke lï na yâ ti ERES (magente) na mbage oko na a yeke kanga lege na mbeni kete ndo na yâ ti ERES. Na ambeni ngoi, mara ti akungba use so kue ayeke lï na yâ ti oko ERES (5) na mbage oko na a yeke kanga ni na mbeni ndo so ayeke yongoro na yâ ti ERES ni. Barre ti échelle, 100 nm.
Na pekoni, a tara mbeni tënë so afa so yongoro chaîne ti acyl ceramide (C26) so ayeke na yâ ti membrane ti ER ayeke pusu mbilimbili bungbingo na kangbingo yâ ti Gas1 ti ga ERES so a soro ni. Ti sara ni, a sara kua na mbeni mara ti levure so a changé ni, GhLag1, so na yâ ni a mû place ti a-synthase use ti ceramide endogène Lag1 na Lac1 na GhLag1 (homologue ti Lag1 ti coton), na a sara si a wara mbeni mara ti levure so ayeke na mbeni membrane ti cellule Ceramide so ayeke nduru na mara ti ceramide ti ngonda (Foto 3A) (2). Azo so abâ lege ti spectrométrie ti masse (MS) afa so na yâ ti akete mara ti nyama, 95% ti acéramide kue ayeke acéramide so ayeke na chaîne ti yongoro mingi (C26), me na yâ ti GhLag1, 85% ti acéramide ni ayeke yongoro mingi (C18 na C16). ), gi 2% ti céramide ni ayeke na yongoro mingi (C26) chaîne ti céramide ni. Atâa so a-céramide C18 na C16 ayeke akota ceramide so a wara na yâ ti membrane ti GhLag1 juska fadeso, gingo nda ti ye na lege ti MS afa nga so ancre ti GPI ti Gas1-GFP so a fa ni na yâ ti mara ti GhLag1 ayeke na a-céramide C26, so a lingbi ti haka ni na mara ti a-lipide ti ngonda. A yeke gi oko ye so (Fig. 3A) (26). Tongaso, ye so aye ti tene so enzyme ti lekengo na ceramide Cwh43 ayeke soro mingi ceramide ti C26, tongana ti so a fa na yâ ti tableau 26, lo yeke sara kua nzoni ti mû ancre ti GPI so alondo na mbeni kete wungo ti ceramide ti C26 so ayeke na yâ ti mara ti GhLag1. S2 (29). Atâa so kue, na yâ ti membrane ti acellule ti GhLag1, a yeke wara gi céramide C18-C16, me Gas1-GFP angbâ ti wara céramide C26. Ye so asara si mara ti mara so ayeke mbeni nzoni ye ti leke na kpale ti yongo ti chaîne ti acyl ti membrane ti céramide so ayeke na yâ ti ER. A yeke hypothétique ti klase na ti sorte. Na pekoni, a manda kozoni ngangu ti C26 Gas1-GFP ti bungbi na yâ ti agroupe na yâ ti GhLag1 na mbeni allele so ayeke changé na yâ ti sec31-1 na lege ti microscope ti fluorescence so azo ayeke sara ka, so gi yongoro chaîne (C18-C16) la ayeke na yâ ti membrane ti ER Céramide (Fig. 3). A bâ so na yâ ti sec31-1, mingi ti Gas1-GFP ayeke na yâ ti agroupe, me Gas1-GFP so ayeke na yâ ti sec31-1 GhLag1 so ayeke na yongoro (C18-C16) yongoro membrane ti ER ti ceramide ayeke mingi ni abungbi pëpe na a kangbi yâ ni na yâ ti Na yâ ti membrane ti ER ni kue. Ti tene e tene tâ tënë, teti so bungbingo ti aye so a leke ni na ceramide ti C26 ayeke ndulu na ambeni mbilimbili ERES (Foto 1), a gi nda ti ye na pekoni ti bâ wala kusala so alingbi nga ti ndu kusala ti kode ti tokuango protéine ti ER na kodoro wande. GPI-AP asala kusala na mbeni système ti COPII so ayeke nde teti tokuango ER na gigi, so a leke ni na lege ti Ted1′s ti leke yâ ti mbage ti glycan ti ancre ti GPI (30, 31). Na pekoni, a yeke hinga GPI-glycan so a kiri a leke ni na lege ti complexe p24 so ayeke mû acargo na yâ ti membrane, so na mbage ti lo ayeke mû Lst1, so ayeke mbeni mbilimbili isoforme ti kota subunité ti COPII so ayeke gbu acargo Sec24, so ayeke sara si a yeke wara mbeni Vésicule ti COPII so ayeke na gbâ ti GPI-AP (33). Tongaso, a leke mbeni ye so ayeke sara si a yeke ngangu pëpe ti zi a-protéine so ayeke oko (composant ti p24 Emp24, enzyme so ayeke sara si GPI-glycan akiri aga nzoni Ted1 nga na mbeni mbilimbili sous-unité ti COPII Lst1) na a-étude ti sec31-1, na a manda ye na ndo ti ala Eskê a lingbi ti sara si a-protéine ti GFP1-clu3 abâ gigi. A bâ so na yâ ti sec31-1emp24Δ nga na sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP ayeke mingi ni abungbi pëpe na a kangbi yâ ti membrane ti ER kue, tongana ti so a bâ kozo awe na yâ ti sec31-1 GhLag1, me na yâ ti sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP ayeke tongana sec3. Azo so abâ ni afa so, na ndo ti so ceramide ti C26 ayeke na yâ ti membrane ti ER, bungbingo ti Gas1-GFP ayeke nga na bezoin ti tingbi na complexe ti p24, na a hunda pëpe ti tene a mû mbeni mbilimbili Lst1 ti sara kua na ni. Na pekoni, a gi ti hinga wala yongo ti chaîne ti ceramide so ayeke na yâ ti membrane ti ER alingbi ti leke yâ ti Gas1-GFP na p24. Me, a bâ so dutingo ti ceramide ti C18-C16 na yâ ti membrane ni ayeke sara pëpe si a-glycan ti GPI so a kiri a leke ni na lege ti p24 (A-image S3 na S4, A na B) wala ti bungbi na GPI-AP na ti tokua GPI-AP na gigi. ngangu ti sarango ye. A yeke wara na yâ ti COPII kete mara ti Lst1 (Foto S4C). Tongaso, bungbingo ti C26 so aluti na ndo ti ceramide ahunda pëpe ti tene aprotéine asara kusala maboko na maboko na alege nde nde ti tokuango aprotéine ti ER, me a mû maboko na mbeni kode ti kangbingo yâ ti aye so ayeke pusu na lege ti yongo ti a-lipide. Na pekoni, a bâ wala yongo ti chaîne ti acyl ti ceramide so ayeke na yâ ti membrane ti ER ayeke kota ye ti tene a sara kua nzoni na Gas1-GFP tongana ERES so ayeke soro ye. Teti so Gas1 na yâ ti mara ti GhLag1 so ayeke na ceramide so ayeke na kete chaîne ayeke sigigi na yâ ti ER na alï na yâ ti membrane ti plasma (Foto S5), a mä ​​na bê so tongana a sara si a soro yongo ti chaîne ti acyl ti ceramide ni, Gas1 so ayeke na yâ ti mara ti GhLag1 alingbi ti kiri ti sara kua na ni ti hon na ni. ERES ayeke na oko membrane ni.
(A) Na yâ ti membrane ti acellule ti GhLag1, a yeke wara mingi ni akete ceramide C18-C16, na ngoi so ancre ti GPI ti Gas1-GFP angbâ ti wara oko IPC ti C26 so ayeke na yâ ti acellule ti ngonda. Na nduzu ge: a bâ yongo ti chaîne ti acyl ti ceramide na yâ ti membrane ti acellule ti mara ti nyama (Wt) nga na ti GhLag1p na lege ti spectrométrie ti masse (MS). Asango ni afa wungo ti ceramide kue so ayeke na yâ ti ngu ni. Moyenne ti a-expérience ota so ayeke nde. Barre ti erreur = SD. Test ti t so ayeke na couple pëpe. **** P <0,0001. Na gbe ni ge: MS abâ lege ti yongo ti chaîne ti acyl ti IPC so ayeke na yâ ti Gas1-GFP (GPI-IPC) ancre ti GPI so a fa ni na yâ ti anyama ti ngonda nga na anyama ti GhLag1p. A yeke wara na yâ ti asango ni wungo ti signal ti IPC kue. Moyenne ti a-expérience oku so ayeke nde. Barre ti erreur = SD. Test ti t so ayeke na couple pëpe. ns, kota ye pëpe. P = 0,9134. (B) A zia na yâ ti micrographe ti fluorescence ti sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ nga na sec31-1lst1Δ so ayeke fa na gigi Gas1-GFP so ayeke na yâ ti galactose so a sara ni na lege ti fluorescence na Perscopy ti si na 37°C teti minute 30. na peko ti 24°C. Flèche ti vuru: ER Gaz1-GFP. Flèche so a zi ni: A kangbi yâ ti Gas1-GFP so ayeke na yâ ti agroupe pëpe na ndo ti membrane ti ER kue, so afa so ER ayeke na akota ye so ayeke na yâ ti a-anneau nucléaire. Barre ti échelle, 5μm. (C) Wungo ti fotomicrographe so a fa tënë ni na (B). A yeke wara na yâ ti acellule so ayeke na punctate Gas1-GFP. Na yâ ti a-expérience ota so azo asara, a wara n≥300 ti acellule. Barre ti erreur = SD. Test ti t so ayeke na couple pëpe. **** P <0,0001.
Ti leke kpale so mbilimbili, a sala kusala na mbeni bango ndo ti SCLIM ti Gas1-GFP na Mid2-iRFP na yâ ti GhLag1 na sec31-1 so ayeke na allele so ayeke sala si ndowa aga nzoni (Foto 4 na Film S4). Na peko ti so a bata ER ni na 37°C na pekoni a zi ni na 24°C, mingi ti afini Gas1-GFP so a leke ni abungbi pëpe na a kangbi yâ ti membrane ti ER ni kue, tongana ti so a bâ na lege ti a-microscope so azo ayeke sara kua na ni (Foto 4, A na B ). Na ndo ni, mbeni kota mbage ti ERES (67%) a yeke wara mara ti akungba use so a bungbi ni oko na yâ ni (Foto 4D). A-panneau 1 na 2 ti tableau 4C afa atapande use ti ERES so ayeke na Gas1-GFP na Mid2-GFP so abungbi tele. Na ndo ni, a mû abongo use so kue na yâ ti oko ERES ni (Foto 4E, panneau 3 na film S4). Tongaso, aye so e wara afa so yongo ti chaîne ti acyl ti ceramide so ayeke na yâ ti membrane ti ER ayeke mbeni kota ye so ayeke sara si aprotéine ti ER abungbi nga ti kangbi yâ ti ala.
A yeke wara na yâ ti a-étude ni so a iri ni Gas1-GFP (GPI-AP, vert) nga na Mid2-iRFP (TMP, bleu) nga na Sec13-mCherry (ERES, magenta) so ayeke na marque ti ERES. Zia ni teti penze-ngbonga 30, zia ni juska na 24°C ti tene a sigigi na asioni ye, na image ni na SCLIM na peko ti penze-ngbonga 20. (A ti si na C) A-image ti projection 2D so afa ye (A; barre ti échelle, 1μm) wala a-image ti hémisphère ti acellule 3D (B na C; unité ti échelle, 0,45μm) ti akete mbage 10 ti z so a zia marque na ndo ni na lege ti cargo nga na ERES. Panneau ti gbe ni na (B) nga na panneau ti (C) afa a-image so a leke ni ti fa gi abongo so ayeke na yâ ti ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) na Mid2-iRFP (bleu clair)]. (C) Flèche so a sara ni na blanc: ERES, abongo so abungbi. Flèche so a zi ni: ERES ayeke gi na mbeni ye oko. Panneau ti gbe ni: ERES so a soro ni ayeke na abongo so abungbi (1 na 2) so a zia marque na ndo ni na (C). Barre ti échelle, 100 nm. (D) Wungo ti fotomicrographe so a fa tënë ni na (C). Na yâ ti a-unité ti sec31-1 na sec31-1 GhLag1, a yeke wara gi mbeni ye oko (Gas1-GFP wala Mid2-iRFP), na a yeke wara na yâ ni wungo ti ERES so ayeke na popo ti akungba so ayeke nde nga na akungba so ayeke na ndo ti mba. Na yâ ti ambeni ye ota so azo asara, a wara n = 432 na yâ ti acellule 54 (sec31-1) nga n = 430 na yâ ti acellule 47 (sec31-1 GhLag1). Barre ti erreur = SD. Test ti t so ayeke na couple pëpe. *** P = 0,0002 (sec31-1) na ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Image 3D ti ERES so a soro ni na cargo so abungbi (3) so a zia marque na ndo ni na (C). Gas1-GFP (vert) na Mid2-iRFP (bleu) ayeke ga nduru na ERES (magenta) na mbage oko na ala yeke ngbâ na yâ ti oko ndo so a kanga lege na ERES dä. Barre ti échelle, 100 nm.
Na yâ ti étude so, a mû na e mbeni ye so afa so a yeke kangbi yâ ti acargo ti protéine so ayeke na yâ ti a-lipide na yâ ti ambeni ndo so a soro ni ti sigigi na ni na yâ ti lege ti secrétion, nga a fa nene ti yongo ti chaîne ti acyl ndali ti so a soro ni ti kangbi yâ ni. Na lege ti mbeni ngangu kode ti bango na ye so ayeke na lege ni mingi so a iri ni SCLIM, a fa so a leke fini Gas1-GFP (mbeni kota membrane ti plasma GPI-AP so ayeke na mbeni mbage ti lipidi ti ceramide ti chaîne ti acyl (C26) so ayo mingi) na yâ ti levure ) Arégion so abungbi na yâ ti a-ER so ayeke nde so a kangbi yâ ni na lege ti ES so ayeke na yâ ti a-ER so ayeke nde, so ayeke na popo ti ala. na yâ ti membrane ti ER (Foto 1). Na ndo ni, mara ti aye use so ayeke lï na yâ ti a-ERES nde nde na lege ti sorongo ye (Foto 2). A yeke wara na yâ ti membrane ni C26 ti si na C18-C16, a yeke sara si abungbi ti Gas1-GFP abungbi na yâ ti a-ER so ayeke nde, na a yeke kiri na lege ti Gas1-GFP ti zia ER na protéine so ayeke na yâ ti membrane ni na lege ti oko ERES ni (Foto 3 na Figure3). 4).
Atâa so GPI-AP ayeke sara kua na mbeni kode ti poroso so ayeke nde ti sigigi na yâ ti ER, a bâ so kangbingo popo ti C26 so abâ lege ti ceramide aluti pëpe na ndo ti abungbi ti poroso so ayeke nde so alingbi ti sara si ERES aga mbeni ye so ayeke nde (Afoto S4 na S5). Nde na so, aye so e wara amû maboko na mbeni kode nde ti kangbingo yâ ti aye so a pusu ni na lege ti bungbingo ti aprotéine so ayeke na yâ ti a-lipide nga na pekoni ti zi ambeni ye nde. Azo so abâ ye so asi afa so ndo wala bungbi ti Gas1-GFP so abungbi na mbeni mbilimbili ERES ayeke na protéine Mid2-iRFP so ayeke sigigi na yâ ti a-transmembrane pëpe, so afa so bungbi ti GPI-AP so ayeke na yâ ti ceramide ti C26 ayeke sara si ala lï na yâ ti ERES so andu ni, nga na oko ngoi ni, a yeke zi na yâ ti a-encre ti transmembrane so ( 2). Nde na so, dutingo ti a-céramide C18-C16 na yâ ti membrane ti ER asara pëpe si GPI-AP abâ gigi na yâ ti arégion wala na yâ ti agroupe, tongaso ala yeke zi pëpe wala ayeke mû place ti a-protéine so alondo na yâ ti membrane ni pëpe na yâ ti oko ERES ni (Afoto 3 na 4). . Tongaso, a yeke na lege ni ti tene so C26 ceramide ayeke pusu kangbingo popo ti aye nga na kangbingo yâ ti aye na lege so lo yeke sara si a yeke ngangu pëpe ti bungbi aprotéine so abungbi na ambeni mbilimbili ERES.
Tongana nyen ti wara bungbingo ti C26 so abâ lege ti ceramide so na yâ ti mbeni mbilimbili ndo ti ER? Tenda ti membrane ti ceramide ti kangbi yâ ti ambage alingbi ti sara si ceramide ti GPI-AP na ti C26 abâ gigi akete lipidi so ayeke na yâ ti ordre hio na yâ ti a-lipidi so ayeke na lege ni pëpe mingi ti membrane ti ER so ayeke na a-glycérolipide so ayeke nduru nga so ayeke na yâ ni pëpe. Abungbi ti nzoni (17, 18). A lingbi ti bungbi akete bungbi ti aye so ayeke ninga pëpe so ti ga akota bungbi so ayeke ngbâ lakue nzoni na peko ti so a tingbi na p24 complexe (34). Na lege ti ye so, a fa so C26 Gas1-GFP ayeke na bezoin ti sala kusala maboko na maboko na p24 ti leke akota bungbi so zo alingbi ti bâ ni (Foto 3). A yeke wara na yâ ti p24 ni mbeni oligomère so ayeke hétérozygote so abungbi aprotéine osio so ayeke nde nde so ayeke na yâ ti levure (35), so ayeke mû lege na abungbi ti aye mingi, so alingbi ti sara si akete groupe ti GPI-AP abungbi oko, na tongaso a yeke sara si akota groupe ti Stable abâ gigi (34). A yeke wara nga na yâ ti a-ectodomaine ti aprotéine ti GPI-AP so a lingbi ti sara si ala bungbi oko, tongana ti so a fa na ngoi so ala yeke gue na Golgi na yâ ti acellule ti épithélium so ayeke polarisé ti anyama so ayeke na mama ( 36 ). Ye oko, tongana ceramide C18-C16 ayeke na yâ ti membrane ti ER, tongana bungbi ti p24 abungbi na Gas1-GFP, akota bungbi so ayeke nde ayeke sigigi pëpe. Ye so ayeke na gunda ni alingbi ti zia bê na ndo ti mbilimbili aye so ayeke na yâ ti tere ti zo nga na aye so ayeke na yâ ti ceramide so ayeke na yongoro chaîne ti acyl. Azo so asara étude na ndo ti a-artificiel afa so atâa so a-acéramide so ayeke na chaîne ti acyl so ayo (C24) nga na so ayeke nduru (C18-C16) alingbi ti sara si a-phase akangbi, gi a-céramide so ayeke na chaîne ti acyl so ayo (C24) la alingbi ti sara si Courbure nga na courbure ti film ni akiri aga nzoni. Na lege ti salango ye na popo ti ala (17, 37, 38). A fa so hélice ti TMED2, so ayeke homologue ti zo ti Emp24, ayeke sara kua na sphingomyéline so ayeke na yâ ti ceramide C18 so ayeke na yâ ti a-lobule ti cytoplasme (39). Na lege ti a-étude ti dynamique moléculaire (MD), a bâ so a-céramide C18 na C26 kue ayeke bungbi na ndo ti a-lobule ti cytoplasme ti hélice transmembrane ti Emp24, na ala yeke na mara ti aye so ala ye (Foto S6). A yeke nzoni ti hinga so ye so afa so hélice ti transmembrane ti Emp24 alingbi ti sara si a kangbi yâ ti a-lipide na yâ ti membrane ni na lege so ayeke asymétrique. So ayeke mbeni ye so asi ade ti ninga pëpe so aluti na ndo ti acellule ti anyama so ayeke na mama. A-image ti MD tongaso afa nga so a yeke wara a-éther (40) . Tongaso, a yeke na lege ni ti tene so C26 ceramide so ayeke na yâ ti a-lobule use ti ER26 ayeke na yâ ti ndo ni. Tongana GPI-AP na yâ ti a-lobule ti lumière abungbi directement na p24 so ayeke na akota valeur mingi nga na bungbingo ti ceramide ti C26 so ayeke na terê ti p24 na yâ ti a-lobule ti cytoplasme, a lingbi ti sara si a-agrégation ti protéine so ayeke na tere ni nga na a-courbure ti membrane abâ gigi na lege ti amaboko (41), na a sara si GPI-AP akangbi yâ ti arégion so ayeke ga adcré. arégion ti membrane ti ER (42). Atondo so asigigi kozoni amû maboko na kode so a fa (43, 44). Na ngoi so a yeke sara kua na a-oligolectine, a-pathogène wala a-anticorps so ayeke sara si a-glycosphingolipide (GSL) so ayeke na yâ ti ceramide abungbi oko, a yeke sara si a-GSL abungbi mingi, a yeke sara si a-phase ni ayeke kangbi yâ ti terê ti zo nga a yeke sara si membrane ni ayeke changé nga ayeke lï na yâ ti ni ( 44 ). Iwabuchi etc. (43) A bâ so na yâ ti akota chaîne ti acyl (C24) me so ayeke nduru pëpe (C16), ligand so ayeke na akota ye mingi so abungbi na lactosylcéramide ti GSL asara si akota bungbi ti aye abâ gigi nga na a-invagination ti membrane, na a-cytoplasme so ayeke na yâ ti cytoplasme so ayeke sara si a-acyl ayeke sara kua na a-neutrôle so ayeke na yâ ti a-acyl.
Na yâ ti acellule ti épithélium so ayeke polarisé, bungbingo ti réseau anti-Golgi (TGN) so ayeke na yâ ti membrane ti plasma apical ayeke sara si a kangbi yâ ti GPI-AP nga a soro ni ( 10, 45 ). A yeke na lege ti oligomérisation ti GPI-AP (36) si a yeke bungbi aye so, me a lingbi nga ti zia lege na yongo ti chaîne ti céramide so e yeke wara na yâ ti levure. Atâa so GPI-AP ti anyama so ayeke na mama ayeke na mbeni ancre so aluti na ndo ti éther, na lekengo ye ti lo ayeke nde mingi na ceramide so ayeke na yongoro chaîne ti acyl mingi, mbeni gingo nda ti ye so ade ti ninga pëpe afa so a-lipide use so kue ayeke na mara ti aye ti mitele nga na ti chimie so ayeke legeoko na lege ti évolution (40). Tongaso, mbage ti éther so ayeke na yâ ti acellule ti anyama so ayeke na mama alingbi ti duti legeoko na ceramide C26 so ayeke na yâ ti levure, na kusala ti lo ayeke ti bungbi oko na ceramide so ayeke na yongoro chaîne na yâ ti membrane ni ti mû maboko na bungbingo ti GPI-AP nga ti kangbi yâ ni. Atâa so a ngbâ ti tara lege so droit, aye so a wara kozo afa so guengo na yongoro chaîne ti acyl ceramide na yâ ti tere ti Golgi ayeke pëpe na lege ti aprotéine so ayeke mû place ti cytoplasme, me a zia bê na ndo ti lekengo a-ancre ti GPI tongana levure. Tongaso, a yeke mo bâ mo tene a yeke na lege ni ti tene a soro ti sara kua maboko na maboko na ceramide ti chaîne acyl so ayo mingi nga na GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) na yâ ti oko vésicule ti yongo ni.
Na yâ ti a-épithélium ti levure nga na ti anyama so ayeke na mama, bungbingo ti GPI-AP nga na kangbingo popo ti lo na ambeni protéine ti membrane ti plasma kue ayeke si kozoni si a si na ndo ti acellule ni. Paladino na amba ti lo. ( 48 ) A bâ so na ndo ti TGN ti a-épithélium ti anyama so ayeke na mama, bungbingo ti GPI-AP ayeke gi pëpe ye so a hunda ti tene a soro ni ti kangbi yâ ti a-GPI-AP na yâ ti membrane ti plasma apical, me a yeke leke nga bungbingo ti a-GPI-AP nga na kusala ti lo so ayeke na yâ ti tere ti zo. Cellule ti surface. Na yâ ti levure, étude so afa so groupe ti GPI-AP so ayeke na ndö ti ER so ayeke na ndö ti ceramide ti C26 alingbi ti leke yâ ti groupe ni nga na kusala ti GPI-AP so ayeke na ndö ti membrane ti plasma ( 24, 49 ). Na lege ti tapande so, a-cellule ti GhLag1 ayeke na allergie na a-inhibiteur ti GPI wala na akode ti kaïngo kobela so ayeke sara ngangu na ndo ti mur ti acellule (28), nga bezoin ti abungbi ti Gas1-GFP so ayeke sara kua (49) ti ceramide ti pointe so a fa ni na yâ ti bungbingo ti a-cellule ti levure afa so G A lingbi ti wara a-conséquence physiologique ti hLag1. Faute ti GPI-AP. Ye oko, ti tara ambeni ye nde ti bâ wala a leke programme ti kusala ti tele ti acellule ni na lege ti ER na lege ti mbeni kode ti kangbingo yâ ti aye so aluti na ndo yongo ti a-lipide ayeke duti ande tënë ti gingo nda ti ye ti e ti kekereke.
A yeke wara na yâ ti Tableau S1 akete mara ti Saccharomyces cerevisiae so a sara kua na ni na yâ ti kua so. A leke a-étude ti MMY1583 na ti MMY1635 ti SCLIM ti sara na a-image ti acellule so ayeke na fini na yâ ti a-image ti W303. A leke a-espèce so ayeke fa Sec13-mCherry so ayeke na mbeni marque ti protéine so ayeke za na lege ti mbeni kode so a iri ni réaction en chaîne de polymérase (PCR) so a sara ni na plasmide ti pFA6a tongana mbeni modèle (23). A leke mara ti Mid2-iRFP so a zia marque na ndo ni na mbeni protéine so ayeke za na gbe ti komandema ti promoteur ti GAL1 tongaso. Na lege ti PCR, a yeke wara na yâ ti vecteur ti pKTiRFP-KAN (matabisi ti E. O’Shea, numéro ti plasmide ti Addgene 64687; Na peko ti so a sara si molongo ti génome ti Mid2-iRFP akono na a cloné ni na yâ ti promoteur ti GAL1, a zia ni na yâ ti site ti Not I-Sac I ti plasmide ti bungbingo ye pRS306. A leke plasmide pRGS7 so aga na pekoni na Pst I ti lï na yâ ti locus ti URA3.
A yeke wara na yâ ti plasmide ti centromère (CEN) gene ti fusion ti Gas1-GFP na gbe ti komandema ti zo so ayeke mû maboko na GAL1, so a leke ni tongaso. A yeke wara na yâ ti plasmide ti pRS416-GFP (24) (matabisi ti L. Popolo) na a cloné ni na yâ ti ndo ti Xma I–Xho I ti plasmide ti CEN pBEVY-GL LEU2 (matabisi ti C) . Miller; Numéro ti plasmide ti addène ni ayeke 51225; 51225; RRID: Mbeti ti ziango na ndo ni_51225). A zia iri ti plasmide so alondo na yâ ni pRGS6. A yeke wara nga na yâ ti gene ti fusion ti Axl2-GFP na gbe ti komandema ti GAL1 so ayeke mû maboko na pBEVY-GL LEU2, na a leke ni tongaso. A yeke wara na yâ ti plasmide ti pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) na lege ti PCR, na a yeke sara si a yeke wara na yâ ti site ti Bam HI-Pst I ti vecteur ti pBEVY-GL LEU2. A zia iri ti plasmide so alondo na yâ ni pRGS12. A fa molongo ti a-oligonucléotide so a sala kusala na ni na yâ ti étude so na yâ ti Tableau S2.
A yeke wara na yâ ti mara ni 0,2% ti adénine nga na 2% ti glucose [YP-dextrose (YPD)], 2% ti raffinose [YP-raffinose] so ayeke na gbâ ti protéine p (YP) so ayeke na yâ ti ngu (1 % ti levure nga na 2% ti protéine ept). (YPR)] wala 2% ti galactose [YP-galactose (YPG)] tongana mbeni ye so ayeke mû carbone, wala na yâ ti mbeni ye so a leke ni na mbeni ye so ayeke kete mingi (0,15% ti base ti azote ti levure nga na 0,5% ti sulfate d’ammonium) ti mû na ndo ni a-acide aminé nga na a-base so alingbi so a hunda ti tene zo awara kobe , Na so ayeke na yâ ni 2% ti glucose wala glucose2 so ayeke na yâ ni. (synthétique ti galactose so ayeke kete mingi) tongana mbeni ye so ayeke mû carbone.
Ti wara a-image na ngoi ti tâ tënë, a zia na yâ ti ngu ti YPR na 24°C na yâ ti bï oko ti si na ngoi ti mid-log. Na peko ti so a zia na yâ ti YPG na 24°C teti ngbonga 1, a zia acellule ni na yâ ti SG na 37°C teti penze-ngbonga 30, na pekoni a gue na ni na 24°C ti tene a zi ni na yâ ti bloc ti secrétion ni. A mû concanavalin A ti leke na acellule ni na ndo ti mbeni diapositive ti verre na a mû image ni na lege ti SCLIM. SCLIM ayeke mbeni bungbi ti akete ye so ayeke na yâ ti Olympus IX-71 nga na mbeni ye so a iri ni UPlanSApo 100×1,4 so ayeke na ouverture ti mafuta (Olympus), mbeni scanner so ayeke tourné na disque so ayeke tourné (Yokogawa Electric), mbeni spectromètre so ayeke sara kua na mbeni ye so a leke ni nde. (Photonique ti Hamamatsu) alingbi ti mû mbeni ye ti bango na ye so ayeke kono yâ ti ye na mbeni ndangba kota ye so ayeke ×266,7 nga na mbeni caméra so ayeke na charge so ayeke sara si a-électron aga mingi (Photonique ti Hamamatsu) (21). A yeke mû a-image na lege ti mbeni logiciel so a leke ni nde (Yokogawa Électric). Ti a-image 3D, a sala kusala na mbeni ye so a leke ni nde ti sala si objectif ni ayengi na nduzu, na a bungbi ambage ti optique ni so ayo 100 nm na popo ti ala na yâ ti mbeni pile. A yeke wara na yâ ti image ti Z-stack ni asango ti voxel 3D, na a yeke sara kua na fonction ti kangbingo yâ ti apoint ti théorie so a sara kua na ni ti sara na microscope ti disque so ayeke tourné ti sara kua na ni ti sara na déconvolution na lege ti logiciel Volocity (PerkinElmer). Na lege ti logiciel Volocity ti leke na lege ti automatique ti gingo nda ti ye na ndo ti ndo so zo ayeke dä, a mû mesure ti ERES so andu nga akungba. A sara kua na logiciel MetaMorph (Appareils moléculaires) ti sara na scanner ti ligne.
Lo sara kua na logiciel GraphPad Prism ti hinga kota ye so ayeke na yâ ti statistique ni. Ti t-test ti Student so ayeke na ayanga use nga na test ti ordinaire ti gingo nda ti ye na lege oko (ANOVA), a bâ so kangbi so ayeke na popo ti agroupe ayeke na kota ngangu na ndo ti P <0,05 (*).
Ti sala kusala na microscope ti fluorescence ti Gas1-GFP, a sala si a-cellule ti phase log akono na bï oko na yâ YPD na a bungbi ni na lege ti centrifugation, a sukula ni fani use na ngu ti ingo so a sala na phosphate, na a zia ni na ndo ti glace teti penze-ngbonga 15 tongaso, na pekoni a sala kusala na ni na gbe ti microscope tongana ti so a fa kozoni awe (Check24). A yeke wara na yâ ti ambeti ti e ambeni ye so a iri ni microscope ti Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1,40 huile PH3 CS) so ayeke na mbeni ye ti bango na ye, mbeni filtre L5 (GFP), mbeni caméra ti Hamamatsu nga na mbeni logiciel ti Application Suite X (LAS X). .
A mû a-échantillon ni na mbeni tampon ti échantillon ti SDS na 65°C teti penze-ngbonga 10, na pekoni a kangbi yâ ni na lege ti électrophorèse na gel ti SDS-polyacrylamide (PAGE). Ti sara kua na immunoblotting, a mû 10 μl ti échantillon na yâ ti mbeni lege oko oko. Kozo ye so a lingbi ti sara kua na ni: A yeke sara kua na mbeni yorö so a iri ni anti-Gas1 so a sara ni na 1:3000, mbeni yorö so a iri ni Emp24 so a sara ni na 1:500 nga na mbeni yorö so a iri ni GFP (mbeni matabisi so alondo na H. Riezman) so a sara ni na 1:300. A mû na ala mbeni yorö so ayeke sara si Pgk1 aga 1:5000 (mbeni matabisi so alondo na J. de la Cruz). Use ye so ayeke mû maboko na zo ti wara kobela ni: A yeke wara na yâ ti a-immunoglobuline G (IgG) ti ngasa so ayeke sara si kobela ni akiri aga nzoni pëpe (HRP). A mû na lo IgG ti ngbo so abungbi na HRP ti tiri na ngbo na mbeni dilution ti 1:3000 (Pierce). A yeke wara na yâ ti ambeti ti e ambeni ye so a iri ni réactif SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Tongana ti so a fa na yâ ti (31), a sara mbeni ye so a iri ni immunoprécipitation naturelle na ndö ti mbage ti ER so a sara si a ga mosoro. Na nduru tënë, sukula a-cellule ti levure na tampon ti TNE [tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, fluorure ti phénylméthylsulfonyl 1 mM nga na mbeni ye so ayeke kanga lege na protease) na 600 nm ( OD600) na 100 optique. A fâ yâ ni na akete perle ti verre, na pekoni a zi akete kete ye ti yâ ti acellule ni nga na akete perle ti verre ni na lege ti centrifugation. Na pekoni, a zia ngu so ayeke na ndo ni na yâ centrifuge na g 17 000 teti penze-ngbonga 15 na 4°C. A kiri a zia pellet ni na yâ ti TNE na a zia digitalis saponin na yâ ni ti tene a zia na yâ ti ni mbeni ndangba wungo ti 1%. A zia na yâ ti ngu ni teti ngbonga 1 na a tourné ni na 4°C, na pekoni a zi aye so ayeke na yâ ti ngu ni pëpe na lege ti centrifugation na 13 000 g na 4°C teti penze-ngbonga 60. Ti tene a sara kua na Gas1-GFP, kozoni kue a lingbi a zia na yâ ti échantillon ni ambeni perle ti agarose so ayeke senge (ChromoTek) na 4°C teti ngbonga 1, na pekoni a zia na yâ ti GFP-Trap_A (ChromoTek) na 4°C teti ngbonga 3. A sukula aperle so a zia na yâ ti ngu ni fani oku na TNE so ayeke na digoxigénine 0,2%, a zi ni na yâ ti tampon ti échantillon ti SDS, a kangbi yâ ni na ndo ti SDS-PAGE, na a bâ ni na lege ti immunoblotting.
Tongana ti so a fa na yâ ti (31), a sara kua na croix ti hinga na ndo ti mbage ti ER so a sara si a ga mosoro. Na nduru tënë, a mû mbage ti ER so a sara si a yeke ngangu pëpe ti wara ni, na a zia na yâ ti ni mbeni ye so a iri ni dithiobis (succinimidyl propionate) 0,5 mM (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, Illinois, États-Unis; 20°C, penze-ngbonga 20). A yeke sara si a yeke wara glycine (50 mM ti ndangba ngu ni, penze-ngbonga 5, 20°C).
Tongana ti so a fa ni kozo awe (50), a sara analyse ti MS ti ceramide na yâ ti anyama ti ngonda nga na anyama ti GhLag1. Na nduru tënë, a sara si a-cellule ni aga kota (3 ti si na 4 OD600 unités/ml) na yâ ti YPD na 30°C, na a mû a-cellule 25×107. A yeke zi yâ ti mênë ti ala na lege ti acide trichloroacétique. Lo mû na ala mbeni ye ti zingo na ni [éthanol, ngu, éther, pyridine nga na hydroxyde d’ammonium 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] nga na 1,2 nmol ti céramide C17 so ayeke na yâ ti ni (860517, lipidi polaire ti Avanti). Lo sala kusala na mbeni ye so a iri ni monométhylamine [méthanol, ngu, n-butanol na solution ti méthylamine (4:3:1:5 v/v)] ti sala si a zia na yâ ti ngu ni mbeni kete hydrolyse alcaline, na pekoni lo sala kusala na n-butanol so ayeke na ngu ti zi na ngu. Na pekoni, a kiri a zia ngu ni na yâ ti mbeni ye so ayeke na mode positif [chloroforme/méthanol/ngu (2:7:1) + acétate d’ammonium 5 mM] na a zia ni na yâ ti spectromètre ti masse. A sara kua na mbeni ye so a iri ni multi-réaction surveillance (MRM) ti hinga na ti hinga wungo ti akete kete ye so ayeke na yâ ti sphingolipide. A yeke wara na yâ ti a-étude ni mbeni robot so ayeke sara kua na a-ion so ayeke na yâ ti a-ion so ayeke na yâ ti a-ion so ayeke na yâ ti a-ion so ayeke na yâ ti a-ion so ayeke na yâ ti a-ion. A yeke leke ngangu ti bungbingo ye ni nzoni teti mara ti ceramide oko oko. A wara asango ti MS na yâ ti nzoni mode. Ti a-réplique biologique oko oko, signal ti lipidi ayeke na popo ti amesure ota so ayeke nde.
Tongana ti so a fa na yâ ti (31), a sara si a-cellule (800×107) so ayeke fa Gas1-GFP abâ gigi na yâ ti tere ti zo. A kangbi yâ ti Gas1-GFP so a sukula ni awe na lege ti SDS-PAGE na a zia ni na yâ ti mbeni membrane so a sara ni na fluorure ti polyvinylidène (PVDF). A bâ protéine ni na lege so a zia couleur na ndo ti PVDF na amide noir. A fâ yâ ti bande ti Gas1-GFP na yâ ti PVDF na a sukula ni fani 5 na méthanol nga fani oko na ngu so ayeke na grade ti chromatographie liquide-MS (LC-MS). Na lege ti 500 μl ti NaOAc 0,3 M (pH 4,0), tampon nga na 500 μl ti fini mélange ti nitrite ti sodium 1 M so a zia na yâ ni na 37°C teti angbonga 3, a yeke zi mbage ti lipidi ni na yâ ti Gas1-GFP na inophasine so a lysé ni. (51). Na pekoni, a sukula bande ti membrane ni fani osio na ngu so ayeke na grade LC-MS, a sara si a sukula ni na ndo so dê ayeke dä mingi, na a bata ni na yâ ti mbeni ndo so ayeke na azote na -80°C juska a bâ ni. Ti bâ ni, a mû mbeni échantillon ti membrane ti PVDF so ayeke senge senge ti sara na experiment oko oko. Na pekoni, a mû lipid so a zi na yâ ti Gas1-GFP na lege ti MS tongana ti so a fa ni (50). Na nduru tënë, a kiri a zia ambeni bande ti PVDF so ayeke na yâ ti GPI-lipide na yâ ti 75μl ti mbeni ye so ayeke sara si a-moule ni aga sioni [chloroforme/méthanol (1:2) + 5 mM ti acétate d’ammonium] na a sara si a sara kua na ionisation électrospray (ESI)-MRM/MS Analyse des espèces de sphingolipide (TSQ Vantage). Na yâ ti aye so, a wara asango ti MS na yâ ti mode ti ion négatif.
Tongana ti so a fa ni kozo awe, a kangbi yâ ti mbage ti lipidi ti ancre ti GPI na GPI-AP so a zia marque na ndo ni [3H]-inositol (16). A kangbi yâ ti a-lipide ni na lege ti mbeni ye so a iri ni solvant (55:45:10 chloroforme-méthanol-0,25% KCl) na a bâ ni na lege ti FLA-7000 (Fujifilm).
A sukula a-cellule so ayeke fa Gas1-GFP (600×107) fani use na tampon ti TNE na tampon ti TNE, na a fâ yâ ni na akete perle ti verre, na pekoni a sara si a zi asaleté ti acellule ni nga na akete perle ti verre. Na pekoni, a zia ngu so ayeke na ndo ni na yâ ti centrifuge na g 17 000 teti ngbonga 1 na 4°C. A sukula a-pellet ni na yâ ti TNE na a zia ni na yâ ti TNE so ayeke na 0,2% ti saponine ti digitalis teti ngbonga 1 na 37°C. Na peko ti so a sara kua na enzyme ni, a zi membrane ni na lege ti centrifugation na g 17 000 na 4°C teti ngbonga 1. Ti tene a sara si Gas1-GFP abâ gigi, a zia na yâ ti ngu ni mbeni ye so a iri ni GFP-Trap_A (ChromoTek) so ayeke na 4°C na yâ ti bï oko. A yeke wara na yâ ti Gas1-GFP so a sukula ni awe so a kangbi yâ ni na lege ti SDS-PAGE na a sara ni na couleur ti Coomassie so ayeke bleu so ayeke za zango. A fâ yâ ti bande ti couleur ti Gas1-GFP so ayeke na yâ ti gris so angoro aqueduc ni, na pekoni na peko ti so a sara alkylation na iodoacétamide nga a sara si a réduire ni na dithiothréitol, a sara digestion na yâ ti gel na trypsine. A yeke wara na yâ ti a-appareil ni tryptique nga na a-appareil so ayeke na GPI-glycan. A yeke wara na yâ ti peptide ni 20 μl ti ngu. A zia mbeni mbage ni (8μl) na yâ ti LC ni. A sala kusala na mbeni colonne ti octadécylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diamètre ti yâ ni ayeke 150 mm×1,0 mm; Nomura Chemical, Préfecture ti Aichi, Japon) ti kangbi yâ ti a-peptide na gbe ti ambeni mbilimbili ye so ayeke na yâ ni. A yeke wara na yâ ti a-appareil ni A (0,08% ti acide formique) nga na B (0,15% ti acide formique na yâ ti 80% ti acétonitrile). A sala kusala na mbeni masini ti HPLC ti Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ti zi na yâ ti colonne ni mbeni ye so ayeke mû ngu na yâ ti ngu A na yâ ti penze-ngbonga 55 na mbeni lege so ayeke sua na 50 μl min-1 teti penze-ngbonga 5, na pekoni a sala si wungo ti ngu so ayeke na yâ ti ngu B ni ague na li ni ti si na 40%. , na Amerika). A yeke ngbâ lakue ti zia éluat ni na yâ ti lingu ti a-ion ti ESI, na a yeke gi nda ti a-ion so ayeke na yâ ti a-ion so ayeke na GPI-glycan na lege ti LTQ Orbitrap XL (spectromètre ti masse ti a-ion so ayeke na ligne hybride; Thermo Fisher Scientific). Na yâ ti setup ti MS, a zia tension ti source ti capillaire ni na 4,5 kV, na a bata wâ ti capillaire ti transfert ni na 300°C. A yeke wara na yâ ti a-capillaire ni nga na a-objectif ti tube ni 15 V nga na 50 V. A wara asango ti MS na yâ ti mode ti ion so ayeke nzoni (résolution ti 60 000; mbilimbili ti masse ti ambage 10 na yâ ti million oko oko) na yâ ti mbeni range ti masse so ayeke 300/m/z ratio ti masse/charge (m/z) 3000. A wara asango ti MS/MS na lege ti piège ti ion so ayeke na yâ ti XLthe Ors3 na kozo LTQ. a yeke wara na yâ ti mbeti ni (CID)].
A sara kua na a-étude ti MD na lege ti logiciel GROMACS (52) nga na mbeni ye ti ngangu ti MARTINI 2 (53-55). Na pekoni, a sala kusala na mbeni ye ti lekengo na a-membrane ti CHARMM GUI (56, 57) ti leke na mbeni couche use so ayeke na yâ ni dioléoylphosphatidylcholine (DOPC) na Cer C18 wala DOPC na Cer C26. A yeke wara topologie na acoordonnées ti Cer C26 na lege ti DXCE na lege so a zi ambeni perle so ayeke na yâ ti sphingosine. Lo sara kua na a-équilibre ti double couche ni ti sara kua na ni, na pekoni lo sara kua na a-ultime coordonnées ti système ni ti leke na mbeni système so ayeke na Emp24. A leke domaine ti transmembrane ti levure Emp24 (résidu 173 ti si na 193) tongana mbeni α-hélice na lege ti mbeni ye ti bango na MD (VMD) so ayeke na yâ ti a-outil ti lekengo na a-molécule (58). Na pekoni, na peko ti so a zi a-lipide so ayeke na ndo ti mba, a sara si protéine ni aga akota ngbongboro ye na a zia ni na yâ ti bilayer ni na lege ti CHARMM GUI. Na pekoni, a yeke wara a-DOPC 1202 na a-Cer C26 302 wala a-DOPC 1197 na a-Cer C18 na Emp24 295. Ionisé système ni na mbeni wungo ti 0,150M. A sara aréplique osio so ayeke nde ndali ti acomposition use so ayeke na couche use.
A yeke sala kusala na kode ti CHARMM GUI ti leke na bilayer ti lipidi ni, so andu salango si a-étape 405 000 aga kete na pekoni a sala si a-étape ni aga kete, na ndo so a yeke sala si a-étape ti position ni adë yeke yeke na a zi ni, na a yeke sala si a-étape ti ngoi ni ague na li ni ti londo na 0,005 ps ti si na 0,02 ps. Na peko ti so a sara équilibre, a yeke sara si 6 μs na mbeni ngoi ti 0,02 ps. Na peko ti so lo zia Emp24, lo sara kua na oko kode ti CHARMM GUI ti sara si système ni aga kete nga ti sara si lo duti na équilibre, na pekoni lo sara kua teti 8 s na yâ ti kua ti lekengo ye.
Ti a-appareil kue, na ngoi ti sarango équilibre, a yeke sara kua na barostat ti Berendsen (59) ti bâ lege ti aye ni, nga na ngoi ti sarango kua na ni, a yeke sara kua na barostat ti Parrinello-Rahman (60). Na yâ ti aye kue, a yeke wara 1 bar na a yeke sara kua na mbeni scheme ti couplage ti pression so ayeke semi-isotrope. Na yâ ti kua ti équilibre nga na ti lekengo ye, a yeke sara kua na mbeni thermostat (61) so ayeke na mbeni réétalonnage ti vitesse ti bungbi na akota ye so ayeke na yâ ti aprotéine, a-lipide nga na a-solvant. Na yâ ti kusala ni kue, a yeke wara 310K. A yeke wara na yâ ti ambeti ti e ambeni ye so a iri ni liste ti pairing na lege ti schéma ti Verlet so ayeke na 0,005 ti tampon. A yeke sala kusala na tënë ti Coulomb ti sala kusala na ndo ti réaction na mbeni yongo ti kongo so ayeke 1,1 nm. Tënë ti Vander Waals asala kusala na mbeni fä ti fä so ayeke na yongo ti fä ti 1,1 nm, na fä ti Verlet asala kusala teti akota ye so alingbi ti gue na li ni (62).
Na lege ti VMD, yongo ti lumière so ayeke na popo ti akete perle ti phosphate ti DOPC wala akete perle ti ceramide AM1 na protéine ni ayeke 0,7 nm, na a yeke diko wungo ti a-lipide so ayeke sala kusala na poroso ni. Na lege ti formule so, diko facteur ti déplétion-enrichissement (DE) tongana ti so a fa na yâ ti (63): Facteur DE = (wungo ti a-lipide kue so ayeke na yâ ti protéine ni 0,7) na yâ ti protéine ni 0,7 (wungo ti Cer so ayeke na yâ ti a-lipide kue) .
A yeke wara ngere so a fa ni tongana mbeni moyenne, na a yeke wara a-erreur so ayeke a-erreur osio so ayeke nde ti SE. A yeke wara na yâ ti test ti t [(moyenne ti DE-facteur-1)/SE]. Calculé ngere ti P so alondo na yâ ti kangbingo ye oko.
A sala kusala na gbakuru ti GROMACS ti sala kusala na carte ti densité latérale 2D ti système so ayeke na Emp24 na yâ ti ndangba ns 250 ti trace ni. Ti wara carte ti enrichissement/déplétion ti ceramide, a kangbi yâ ti carte ti densité ti Cer na wungo ti carte ti Cer na ti DOPC, na pekoni a kangbi yâ ni na wungo ti Cer so ayeke na yâ ti tere ti zo. A yeke sala kusala na oko échelle ti carte ti couleur ni.
Ti wara ambeni ye nde ti sara na article so, bâ ndo na ndo ti site ti e.
A yeke mbeni article so azo kue alingbi ti wara ni so a kangbi ni na gbe ti andia ti Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, so amû lege ti sara kua na ni, ti kangbi ni nga ti kiri ti sara ni na mbeni lege nde, gi tongana ndangba kusala ni ayeke pëpe ti wara na nginza nga so ye so a fa ayeke so kozo mbeti ni ayeke na lege ni. Zo ti ba.
Note: E hunda gi na mo ti mû adresse e-mail ti mo tongaso si zo so mo recommandé lo na ndö ti page ni ahinga so mo ye ti tene lo bâ e-mail ni nga so a yeke spam ape. A yeke mû ande pëpe adresse ti e-mail.
A yeke sara kua na hundango ndo so ti tara wala mo yeke mbeni vizite nga ti kanga lege na tokuango asango ti spam automatiquement.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Lorgihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
A-image ti 3D so ayeke na kota résolution afa nene ti yongo ti chaîne ti céramide ti kangbi yâ ti aprotéine na yâ ti ando so a soro ni ti sigigi na ni.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Lorgihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
A-image ti 3D so ayeke na kota résolution afa nene ti yongo ti chaîne ti céramide ti kangbi yâ ti aprotéine na yâ ti ando so a soro ni ti sigigi na ni.
©2020 Bungbi ti Amerika ti guengo na li ni ti senda-ye. a yeke bata droit kue. AAAS ayeke mbeni mba ti HINARI, AGORA, OARE, CHORALE, CLOCKSS, CrossRef na COMPTEUR. ISSN 2375-2548 ti senda-ye.