Merci so mo gue na ndo ti Nature.com. Version ti navigateur so mo yeke sara kua na ni ayeke na gbâ ti CSS. Ti wara anzoni ye, a yeke nzoni mo sara kua na mbeni fini version ti navigateur ti mo (wala mo kanga Mode ti compatibilité na yâ ti Internet Explorer). Na yâ ti ngoi ni so, ti tene a mû maboko na e lakue, e yeke fa site ni sân ti tene a sara style wala JavaScript.
A yeke sala kusala na acide propionique (PPA) ti manda kusala ti mitochondrie so ayeke sala kusala nzoni pëpe na yâ ti akobela ti li tongana kobela ti spectre ti autisme. A hinga so PPA ayeke buba yâ ti biogénèse ti a-mitocondrie, ti sara si a-organisme ti terê ti zo akiri aga nzoni. Me, ngangu so PPA ayeke sara na ndo ti ngangu ti mitochondrie, fission nga na fusion angbâ lakue ti duti mbeni kpale ndali ti so aye so ayeke sara kua na yâ ti ngoi ayeke ngangu mingi. Na ndo so, a sala kusala na akode ti bango na lege ti wungo ti aye so ayeke mû maboko na zo ti gi ti hinga tongana nyen PPA ayeke sala ngangu na ndo ultrastructure ti mitochondrie, na ndo tele ti lo, nga na ndo salango ye ti lo na yâ ti acellule SH-SY5Y so ayeke tongana a-neuron. PPA (5 mM) asara si a yeke ngangu pëpe ti tene a zia na yâ ti mitochondrie (p < 0,01), diamètre ti Feret nga na circonférence ti lo (p < 0,05), nga na 2 (p < 0,01). Azo so abâ lege ti aye so ayeke si na yâ ti mitochondrie afa so aye so asi na yâ ti fission nga na fusion ague na li ni mingi (p < 0,05), na tongaso a bata be-biani ti réseau ti mitochondrie na yâ ti aye ti ngangu. Na ndo ni, a yeke wara na yâ ti mRNA ti cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) nga na OPA1 (p < 0,05). 01). Ye so afa so a yeke kiri ti leke yâ ti mitochondrie, biogénèse nga na dynamique ti tene a ngbâ ti sara kua nzoni na yâ ti aye so ayeke sara si zo ayeke na kota vundu. Asango ti e amû afini hingango ye na ndo ti ngangu so PPA ayeke sara na ndo ti ngangu ti mitochondrie nga afa nga nzoni ti akode ti bango na image ti manda na akpengba kode ti lekengo ye so ayeke na yâ ti akiringo tënë ti akpale ti mitochondrie.
A-mitocondrie ayeke akota mbage ti akusala nde nde ti acellule so ahon ti so ala yeke sala ka na yâ salango ngangu nga na biosynthèse. Na yâ ti mitochondrie, a yeke wara akota ye so ayeke sara si calcium ayeke sara kua nzoni, a-homéostase ti métabolisme na ti redox, a-inflammation, a-épigénétique, a-épigénétique, a-prolifération ti a-cellule, a-différentiation nga na kuâ ti a-cellule so a leke ni awe1. Na yâ ti ambeni ye, a yeke kota ye mingi ti tene a-neurone amaï, ti ngbâ na fini nga ti sara kua nzoni nga a yeke sara kua mingi na yâ ti a-neuropathologie nde nde2,3,4.
Na yâ ti angu bale-oko so ahon, dutingo ti métabolisme asigigi tongana mbeni kota ye so ayeke leke yâ ti neurogénèse, kangbingo popo ti aye, maïngo nga na plasticité5,6. Ade ti ninga pëpe, lekengo tele ti amitochondrie nga na ngangu ti ala aga mbilimbili akota mbage ti mitose, mbeni kusala so ayeke sala kusala ngangu so ayeke bata mbeni bungbi ti amitochondrie so ayeke nzoni na yâ ti acellule. A yeke na lege ti akota lege so ayeke na popo ti ala si a yeke leke ngangu ti a-mitochondrie, so alondo na biogénèse ti a-mitochondrie nga na bioénergie ti si na fission, fusion, transport nga na clearance7,8. Ti buba yâ ti mbeni oko ti akode ti bungbingo ye so ayeke buba yâ ti batango aréseaux mitochondrie so ayeke nzoni nga ayeke na akota ye ti pekoni na ndo ti developpement ti li9,10. Biani, a yeke wara dysrégulation ti dynamique ti mitochondrie na yâ ti gbâ ti akobela ti li, ti li nga na ti developpement ti li, so na popo ni a yeke wara akobela ti spectre ti autisme (ASD)11,12.
ASD ayeke mbeni kobela so ayeke sara si li ti zo ayeke maï nzoni pëpe, na a yeke wara gbâ ti aye so ayeke na yâ ti génétique nga na épigénétique. Azo alingbi ti dë kite pëpe na ndo ti tënë ti héritier ti ASD, me a hinga pëpe nzoni ye so ayeke na gunda ti kobela ni. Ti bungbi asango so alondo na a-modèle ti préclinique, a-étude ti clinique, nga na a-ensemble ti asango ti amolécule so ayeke na a-omics mingi amû lege ti hinga mingi so mitochondrie ayeke sara kua nzoni pëpe na yâ ti ASD13,14. A yeke kozoni ti tene a sara mbeni écran ti méthylation ti ADN na yâ ti mbeni groupe ti azo ti kobela so ayeke na ASD na a hinga agene so ayeke na méthylation nde nde so abungbi na ndo ti alege ti métabolisme ti mitochondrie15. Na pekoni, a sara tënë ti méthylation différentiel ti arégulateur central ti biogénèse nga na ti dynamique ti mitochondrie, so ague oko na guengo na li ni ti wungo ti copie ti mtDNA nga na changement ti profil ti métabolisme ti ngu na yâ ti ASD16. Asango ti e afa mingi ahon ti kozo so dynamique ti mitochondrie nga na hôméostase ayeke sala kota kusala na yâ ti pathophysiologie ti ASD. Tongaso, ti sala si a hinga ye nzoni na ndo songo so ayeke na popo ti ngangu ti mitochondrie, lege so a leke na tele ti zo, na kusala ti lo ayeke mbeni kota ye so a zia na gbele azo ti gi nda ti ye lakue na ndo akobela ti li so asala si a-mitochondrie asala kusala nzoni pëpe.
Fani mingi, a yeke sala kusala na akode ti molécule ti manda kusala ti ambeni mbilimbili gene na yâ ti akiringo tënë ti akpale ti mitochondrie. Ye oko, kode so alingbi ti duti na akatikati ndali ti so akode ti komande ti mitose ayeke na alege mingi nga ayeke ninga pëpe. Na ndo ni, fango na gigi kangbi so ayeke na popo ti agene ti mitochondrie ayeke mbeni ye so afa na lege ti fä pëpe so ambeni ye achangé na yâ ti kusala ti ala, mbilimbili teti so a yeke gi mbeni kete wungo ti agene si a yeke gi nda ni mingi. Tongaso, a leke ambeni kode so ayeke mbilimbili mingi ti manda na kusala ti mitochondrie nga na bioénergie17. A yeke wara na yâ ti a-mitocondrie ni aye so ayeke sara si a-mitocondrie ni ayeke sara kua nzoni. Forme ti mitochondrie, tingbingo tele, na lekengo ye ayeke kota ye mingi teti salango kusala na ngangu nga na fini ti mitochondrie na ti acellule5,18. Na ndo ni, ambage nde nde ti mitose aluti mingi na ndo achangement so ayeke si na yâ ti mitochondrie, so alingbi ti sara kua tongana anzoni ye ti hunzingo na kpale ti mitochondrie nga ti mû mbeni gunda ti mandango ye na ndo ti aye so ayeke si na pekoni.
A lingbi ti bâ lege so a-mitocondrie ayeke sara kua na ni na lege ti microscope électronique (TEM), so amû lege ti manda anzene nzene ye na ndo ti akota ye so ayeke na yâ ti acellule. TEM ayeke bâ mbilimbili lege so a-mitocondrie ayeke sara ye, forme nga na lekengo ye ti ala na lege ti résolution ti a-mitocondrie oko oko, ahon ti zia bê ti ala gi na ndo ti sungo peko ti agene, fango na gigi a-protéine wala na ndo ti a-paramètre ti kusala ti a-mitocondrie na yâ ti gbâ ti a-cellule17,19,20. Na ndo ni, TEM ayeke mû maboko ti manda ye na ndo ti asarango ye so ayeke na popo ti amitocondrie na ambeni ye nde, na tapande réticulum endoplasmique nga na autophagosomes, so ayeke sara kota kua na yâ ti kusala ti amitocondrie nga na hôméostase21,22. Tongaso, ye so asala si TEM aga mbeni nzoni tongo nda ti mandango ye na ndo salango kusala ti mitochondrie kozoni si a zia lê na ndo ambeni mbilimbili lege wala agene. Na ngoi so kusala ti mitochondrie ayeke ga kota ye mingi na yâ ti senda-ye ti neuropathologie, a yeke polele so a hunda ti wara lege ti manda ye mbilimbili nga na lege ti wungo ti aye so ayeke na yâ ti mitochondrie nga na lege so a yeke sara kua na ni na yâ ti a-in vitro.
Na yâ ti article so, a yeke bâ aye so ayeke sara si a-mitochondrie ayeke sara kua nzoni na yâ ti mbeni model ti neuron so ayeke sara si a-mitocondrie ayeke sara kua nzoni pëpe na yâ ti kobela ti spectre ti autisme. A yeke wara na yâ ti ASD15, mbeni kete mbage ti enzyme PCC so ayeke na yâ ti mitochondrie. Azo ahinga so dysrégulation ti PCC ayeke sara si abungbi asioni ye so ayeke na yâ ti propionyl, so na popo ni a yeke wara acide propionique (PPA)23,24,25. A fa so PPA ayeke buba yâ ti métabolisme ti a-neurone nga ayeke changé sarango ye ti zo na yâ ti tere ti lo nga a yeke mbeni tapande ti nyama so a leke ni awe ti manda na akode ti developpement ti a-neurone so ayeke na yâ ti ASD26,27,28. Na ndo ni, a tene so PPA ayeke buba yâ ti ngangu ti membrane ti mitochondrie, biogénèse nga na pupu na yâ ti a-in vitro na a sara kua na ni mingi ti fa tongana nyen la mitocondrie ayeke sara kua nzoni pëpe na yâ ti a-neuron29,30. Ye oko, a hinga pëpe ngangu so PPA ayeke sara na ndo ti lege so a-mitochondrie ayeke sara kua nzoni nga na ngangu ti ala.
Na yâ ti étude so, a sara kua na ambeni kode ti bango na image ti hinga wungo ti aye so PPA ayeke sara na ndo ti forme ti mitochondrie, ngangu ti ala nga na kusala ti ala na yâ ti acellule ti SH-SY5Y. Kozoni, a leke mbeni kode ti TEM ti bâ na lê ti zo achangement so ayeke si na yâ ti mitochondrie nga na ultrastructure17,31,32. Na bango ngangu ti mitochondrie33, a sala nga kusala na mbeni ye ti gingo nda ti ye (MEL) ti hinga wungo ti achangement so ayeke si na yâ ti équilibre so ayeke na popo ti aye so asi na yâ ti fission na fusion, wungo ti amitochondrie nga na wungo ti aye so ayeke na yâ ti ngu na gbe ti ngangu ti PPA. Na pekoni, a bâ wala lege so a-mitocondrie ayeke sara kua na ni ayeke sara si achangement asi na yâ ti sarango ye ti agene so ayeke na yâ ti biogénèse, fission nga na fusion. Tongana a bungbi asango ti e kue, a yeke ngangu ti fa nda ti aye so ayeke sara si a-mitochondrie ayeke sara kua nzoni. A fa nga nzoni ti TEM na yâ ti mandango ye na ndo ti mitochondrie tongana mbeni ye so a lingbi ti mû mesure ni na nda ti mitose so ayeke na yâ ti acellule ti SH-SY5Y. Na ndo ni, a fa so asango ti TEM ayeke mû asango so ayeke na mosoro mingi tongana a bungbi ni na akode ti bango na image so ayeke gbu nga aye so ayeke si na yâ ti tere ti zo. Ti kiri ti hinga ye mingi na ndo ti akode ti lekengo na a-molécule so ayeke mû maboko na mitose ti acellule ti neuron alingbi ti mû lege na e ti hinga akota ye na ndo ti mbage ti mitochondrie ti système nerveux nga na akobela so ayeke buba yâ ti li ti zo.
Ti tene a sara si a-mitochondrie abâ gigi, a sara kua na a-cellule ti SH-SY5Y na PPA so a sara kua na propionate ti sodium (NaP) 3 mM nga na 5 mM. Kozoni na TEM, a mû a-échantillon ti leke na a-échantillon na lege ti cryogène na lege ti congélation so ayeke na kota pression nga na congélation (Fig. 1a). A leke mbeni tuyau ti gingo nda ti image ti mitochondrie so ayeke sara kua na automatique ti mû mesure ti aparamètre osio ti morphologie ti azo ti mitochondrie na yâ ti a-réplique ti biologie ota. A bâ so salango kusala na PPA achangé mingi aye osio: ndo 2, ndo, périmètre, na diamètre ti Feret (Fig. 1b–e). Azo ti kodoro ni 2 adë mingi na lege ti akode ti kaïngo kobela ti PPA 3 mM na 5 mM (p = 0,0183 na p = 0,002, na lege ti mbaï) (Fig. 1b), na ngoi so azo ti kodoro ni (p = 0,003), périmètre ni (p = 0,0106) nga na diamètre ti Feret ni kue adë mingi. A yeke wara nga mbeni kota wungo ti azo so a mû na ala yorö ti 5 mM (p = 0,0172) tongana a haka ni na azo so a mû na ala yorö ti bango ndo na ndo ti ala (Fig. 1c–e). Akota ye so a sara na ndo ti ndo ni nga na ndo so angoro ni afa so acellule so a sara kua na PPA 5 mM ayeke na akete mitocondrie so ayeke ronde mingi, nga so a-mitochondrie so ayeke yongoro mingi pëpe ahon ti so a sara na yâ ti acellule so a sara kua na ni. Ye so ague nga oko na mbeni kota guengo na li ni ti diamètre ti Feret, mbeni paramètre so ayeke nde so afa so kota yongo so ayeke na popo ti akete kete ye so ayeke na yâ ti ngu ni akiri na peko. A bâ so achangement asi na yâ ti ultrastructure ti a-cristae ni: a-cristae ni aga kete na gbe ti ngangu ti PPA (Fig. 1a, panneau B). Ye oko, a yeke pëpe a-image kue la afa polele ultrastructure ti cristae ni, tongaso a sara pëpe mbeni gingo nda ti ye na ndo ti wungo ti achangement so. Asango ti TEM so alingbi ti fa aye ota so alingbi ti si: (1) PPA ayeke sara si fission wala akanga lege na fusion, na a sara si a-mitochondrie so ayeke dä awe ayeke kiri na peko; (2) biogénèse so akono ayeke sara si afini mitocondrie so ayeke kete mingi abâ gigi wala (3) a yeke sara si aye use so kue ayeke sara kua na oko ngoi. Atâa so a lingbi pëpe ti hinga kangbi so ayeke na popo ti aye so na lege ti TEM, akota gbiango ye so asi na yâ ti tere ti zo afa so achangement asi na yâ ti hôméostase ti mitochondrie nga na ngangu so lo yeke sara na gbe ti ngangu ti PPA. Na pekoni, a gi ambeni paramètre nde ti fa na gigi a-dynamique so nga na akode so alingbi ti si so ayeke na gunda ni.
Acide propionique (PPA) ayeke leke yâ ti amitochondrie. (a) A-image ti microscopie électronique ti transmission (TEM) so afa so kota ti amitochondrie ayeke kiri na peko na a-mitochondrie ayeke ga kete na ayeke ga ronde mingi tongana a yeke mû yorö ti PPA mingi; 0 mM (so a sala kusala na ni pëpe), 3 mM na 5 mM, na lege ti mbaï. Akete flèche afa mitocondrie. (b–e) A leke a-cellule ti SH-SY5Y so a sara kua na PPA teti ngbonga 24 ti sara na TEM na a sara kua na Fiji/ImageJ. Na popo ti aparamètre osio so, a yeke wara akota kangbi na popo ti acellule so a mû yorö na ni pëpe (so a sara kua na ni pëpe, 0 mM PPA) nga na acellule so a sara kua na ni (3 mM na 5 mM PPA). (b) Région 2, (c) Zoa, (d) Périmètre, (e) Diamètre ti Feret. A sara kua na mbeni analyse ti variance so ayeke na lege oko (contrôle vs. traitement) nga na test ti Dunnett ti hakango ye mingi ti hinga akota kangbi so ayeke na popo ti ala (p < 0,05). A-point ti donnée afa wungo ti mitochondrie so ayeke na yâ ti acellule oko oko, na a-erreur ni afa wungo ti ± SEM. Asango so a fa ni afa n = 3, kamême acellule 24 na yâ ti réplique oko oko; a bâ a-image 266 kue; * afa so p < 0,05, ** afa so p < 0,01.
Ti hinga nzoni mingi tongana nyen la a-mitocondrie ayeke sara kua na PPA, a sara si a-mitocondrie ni aga éster éthylique ti tétraméthylrhodamine (TMRE) na a sara kua na microscope ti ngoi nga na analyse ti MEL ti hinga ndo so a-mitocondrie ni ayeke dä nga ti hinga wungo ti ala na peko ti angbonga 24 na PPA 3 na 5 mM. A yeke sara kua na fission nga na fusion. (Foto 2a). Na peko ti so a gi nda ti ye na lege ti MEL, a kiri a bâ yâ ti amitochondrie ti hinga wungo ti akete kete ye so ayeke na yâ ti amitochondrie ni nga na wungo ti ala so ayeke na yâ ti moyenne ni. A bâ so wungo ti aye so ayeke si na yâ ti 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] ague na li ni mingi tongana a haka ni na aye so ayeke si na yâ ti ngu [5,6 ± 0,3 (p < 0,05) )] nga na fusion [5,4 ± 0,5 (p < 0,05).) nga na fusion [5,5 (p < 0,05).) . 0,05)] <0,05)] aye so asi ayeke kota mingi na 5 mM tongana a haka ni na azo so abâ lege ti ala (Fig. 3b). Wungo ti amitochondrie ni ague na li ni mingi na 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] nga na 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c) , na ngoi so wungo ti akete kete ye oko oko angbâ gi tongaso (Fig. 1). 3d). Tongana a bungbi aye so kue, a fa so lekengo yâ ti aye so ayeke na yâ ti a-mitochondrie ayeke sara kua tongana mbeni ye so ayeke sara si réseau ti a-mitochondrie ni angbâ nzoni. Akota ye so ayeke si na yâ ti 3 mM PPA afa so wungo ti a-mitochondrie so ayeke na yâ ti a-mitochondrie ayeke na mbeni mbage ndali ti so a-mitochondrie ayeke kangbi yâ ti ala, me teti so wungo ti a-mitochondrie so ayeke na yâ ti moyen ni angbâ lakue gï tongaso, a lingbi ti ke pëpe so biogénèse ayeke mbeni ye nde so ayeke sara si a-mitochondrie ni akiri aga nzoni. Me, asango so ague oko na akete kete ye so ayeke na yâ ti mitochondrie so ayeke ronde so TEM abâ ni nga afa nga akota changement so ayeke si na yâ ti mitochondrie so PPA ayeke sara.
Acide propionique (PPA) ayeke sara si a-mitocondrie ti terê ti zo angbâ lakue nzoni. A zia na yâ ti a-cellule ti SH-SY5Y, a sara kua na PPA 3 na 5 mM teti angbonga 24 na a zia na yâ ni TMRE nga na Hoechst 33342 na pekoni a sara analyse ti MEL. (a) A-image ti microscope so ayeke mû ngoi mingi so afa couleur nga na akota ye so a sara na ngoi 2 (t2) ndali ti aye oko oko. A soro ambeni ndo so a fa ni na yâ ti image binaire oko oko ti sara si a ga nzoni na a fa ni na 3D na yâ ti angoi nde nde ota (t1-t3) ti fa aye so ayeke si na yâ ti angoi nde nde; a yeke fa aye so asi na yâ ti fusion ni na vert; a yeke fa aye so asi na fission na vert. A fa ni na rouge. (b) Moyenne ti wungo ti aye so ayeke si na yâ ti mbeni ye oko oko. (c) Wungo ti akete kete ye so ayeke na yâ ti acellule oko oko. (d) Moyenne ti volume (μm3) ti akota ye so ayeke na yâ ti acellule oko oko. Asango so a fa ni ayeke fä ti n = 15 ti acellule na yâ ti groupe ti kaïngo kobela oko oko. A-erreur so a fa ni ayeke moyenne ± SEM, a-échelle = 10 μm, * p < 0,05.
Acides propioniques (PPA) ayeke sara si a-gene so ayeke na yâ ti a-mitocondrie ayeke sara kua nzoni pëpe. A yeke wara na yâ ti a-cellule ti SH-SY5Y PPA 3 na 5 mM teti ngbonga 24. A sara kua na RT-qPCR ti hinga wungo ti agene so ayeke na yâ ti tere ti zo na a normalisé ni na B2M. A yeke wara na yâ ti a-mitochondrie ni (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 nga na (d) NFE2L2. A yeke wara na yâ ti a-mitocondrie ni aye so ayeke sara si a-mitochondrie abungbi (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 nga (i) DRP1. Akota kangbi (p < 0,05) a tara ni na lege ti ANOVA ti lege oko (contrôle vs. traitement) nga na test ti hakango ye mingi ti Dunnett: * afa p < 0,05, ** afa p < 0,01, na **** afa p < 0,0001. Abarre ni ayeke moyenne ti tënë ± SEM. Asango so a fa na gigi ayeke n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), na n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) ti azo so ayeke na fini.
Asango so alondo na yâ ti a-analyse ti TEM na ti MEL afa so PPA ayeke changé lege so a-mitocondrie ayeke sara kua na ni nga na ngangu ti ala. Ye oko, akode ti bango na a-image so amû lege pëpe ti hinga aye so ayeke na gunda ti aye so ayeke pusu azo ti sara aye so. Tongaso, a bâ lege so mRNA ti akota ye 9 so ayeke sara si a-mitochondrie ayeke sara kua nzoni, a-biogénèse nga na a-mitose ayeke sara kua nzoni na yâ ti a-mitochondrie. A yeke wara na yâ ti a-oncogène ti myélome ti acellule (cMYC), facteur ti pupu ti nucléaire (NRF1), facteur ti transcription ti mitochondrie 1 (TFAM), facteur ti transcription so ayeke tongana NFE2 BZIP (NFE2L2), protéine 2 so ayeke tongana gastrine (STOML2), atrophie ti nerf optique 1 (OPA1), Mitofu1. dynamin 1 (DRP1) na peko ti so a mû na lo PPA 3 mM nga na 5 mM teti angbonga 24. A yeke wara na yâ ti PPA ni 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 na p < 0,0001, na lege ti mbaï) nga na 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001). (Bâ 3a-c). A yeke na lege ni ti tene so mRNA ayeke sara kua nzoni: cMYC, NRF1 na TFAM ayeke sara kua fani 5,7, 2,6 na 1,9 na 3 mM, nga fani 11,2, 3 na 2,2 na 5 mM. Na yâ ti ambeni ye, a changé pëpe gene ti biogénèse ti redox centrale NFE2L2 na yâ ti mbeni wungo ti PPA, atâa so a bâ mara ti ye tongaso so abâ lege ti dose ti sarango si a yeke sara kua nzoni (Fig. 3d).
A bâ nga lege so agene ti classique so ayeke na yâ ti lekengo ye ti fission na ti fusion ayeke fa na gigi. Azo apensé so STOML2 ayeke mû mbage na yâ ti fusion, mitophagie nga na biogénèse, na a yeke sara si a yeke ngangu pëpe ti tene a sara kua na ni (p < 0,0001) na lege ti 3 mM (changement ti fani 2,4) nga na 5 mM (changement ti fani 2,8) ti PPA (Fig. 1). 3d). Legeoko nga, a yeke wara na yâ ti 3 mM (changement ti fani 1,6) nga na 5 mM (changement ti fani 1,9) PPA (p = 0,006 na p = 0,0024, na lege ti mbaï) (Fig. 3f). Me, a yeke wara pëpe akota kangbi na yâ ti fango peko ti agene ti fusion MFN1, MFN2 wala agene ti fusion DRP1 na gbe ti ngangu ti PPA ti ngbonga 24 (Fig. 3g–i). Na ndo ni, a bâ so wungo ti a-protéine osio so ayeke sara si a-protéine ti fusion na ti fission (OPA1, MFN1, MFN2 na DRP1) achangé pëpe na yâ ti oko ye so (Fig. 4a–d). A yeke kota ye ti hinga so asango so afa gi mbeni ngoi oko na a lingbi ti fa pëpe achangement so asi na yâ ti poroso wala na yâ ti akusala ti zo na ngoi ti akozo ngoi ti kpale ti PPA. Me, akota ye so asi na yâ ti cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, na OPA1 afa so akota ye so ayeke sara si a-mitochondrie ayeke sara kua nzoni pëpe, a yeke sara si a-mitocondrie ayeke sara kua nzoni pëpe. Na ndo ni, asango so afa so akode ti bango na image ayeke nzoni ti manda mbilimbili achangement so ayeke si na yâ ti kusala ti mitochondrie.
A yeke wara na yâ ti aprotéine ti fusion na ti fission ni ambeni ye so achangé pëpe na peko ti so a mû na lo acide propionique (PPA). A yeke wara na yâ ti a-cellule ti SH-SY5Y PPA 3 na 5 mM teti ngbonga 24. A mû wungo ti aprotéine na lege ti mbeni ye so a iri ni Western blot, na a sara si wungo ti aprotéine ni aga normale. A fa na gigi moyen ti poroso nga na a-Western blot so ayeke représenté poroso ti cible nga na ti poroso kue. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Abarre ni afa moyenne ± SEM, na asango so a fa ni afa n = 3 arépliques biologiques. A sara acomparaison mingi (p < 0,05) na lege ti mbeni analyse ti variance so ayeke na lege oko nga na test ti Dunnett. A yeke wara na yâ ti tableau S1 akozo gel na blot.
A yeke wara na yâ ti a-mitochondrie akobela so ayeke na yâ ti a-système mingi so alondo na akobela ti metabolisme, ti bê nga na ti muscle ti si na akobela ti li1,10. Mingi ti akobela ti li nga na ti li ayeke na lege ti salango kusala nzoni pëpe ti mitochondrie, na ye so afa nene ti akete kete ye so na yâ ti fini ti cerveau kue. Azo so ayeke na kobela ti Parkinson, kobela ti Alzheimer nga na kobela ti ASD3,4,18. Ye oko, ti wara anyama ti yâ ti cerveau ti manda na ndo ti akobela so ayeke ngangu, mbilimbili na ndo ti aye so ayeke sara si a yeke ngangu pëpe ti sara kua na a-système ti model ti acellule. Na yâ ti étude so, a sara kua na mbeni système ti model ti acellule so a sara kua na a-cellule SH-SY5Y so a sara kua na PPA ti kiri ti sara tënë ti kpale ti mitochondrie so a bâ ni na yâ ti akobela ti neurone, mbilimbili akobela ti spectre ti autisme. Ti sala kusala na model ti PPA so ti manda ye na ndo salango ye ti a-mitochondrie na yâ ti a-neuron alingbi ti mû lege ti hinga ye so ayeke na gunda ti ASD.
A gi ti hinga lege so a lingbi ti sara kua na TEM ti bâ achangement so ayeke si na yâ ti mitochondrie. A yeke kota ye ti hinga so a lingbi a sala kusala na TEM nzoni ti sala si a sala kusala nzoni mingi. Ti leke a-échantillon ti cryo amû lege ti bata nzoni abungbi ti a-neurone na lege so a yeke leke na oko ngoi ni ambeni mbage ti acellule nga ti sara si a-artefact abâ gigi pëpe34. Na lege ti ye so, a bâ so acellule ti SH-SY5Y so ayeke tongana a-neuron ayeke na akete kete cellule so ayeke nzoni nga na a-mitocondrie so akono (Fig. 1a). Ye so afa so akode ti lekengo ye na lege ti cryogène ayeke nzoni mingi ti manda na ndo ti lege so a-mitochondrie ayeke sara kua na ni na yâ ti a-échantillon ti acellule ti neuron. Atâa so a yeke kota ye ti mû amesure ti wungo ti aye ti tene a bâ yâ ti asango ti TEM na lege ni, azo angbâ ti mä tere pëpe na ndo ti ambeni mbilimbili ye so a lingbi a mû ti mû mesure ni ti fa so ambeni ye achangé na yâ ti mitochondrie. Na lege ti gbâ ti a-étude so abâ lege ti mitochondrie17,31,32, a leke mbeni tuyau ti gingo nda ti image ti mitochondrie so ayeke sara kua na automatique so ayeke mû mesure ti aparamètre osio ti mitochondrie, so ti tene: ndo, ndo2, ratio ti aspect, périmètre, circulaire, degré , diamètre ti Feret. na ronde.
Na popo ti ala, PPA asara si ndo 2, ndo, périmètre nga na diamètre ti Feret adë mingi (Fig. 1b–e). Ye so afa so amitochondrie aga kete na a yeke ronde mingi, ye so ague oko na ambeni gingo nda ti ye so a sala kozoni awe so afa so ndo ti mitochondrie ni akiri na peko na peko ti so PPA30 asala kusala na ngangu ti mitochondrie ni teti angbonga 72. Akota ye so ayeke na yâ ti tere ti zo alingbi ti fa so a yeke kangbi yâ ti a-mitochondrie, mbeni ye so a hunda ti sara ti tene a zi ambeni ye so abuba na yâ ti réseau ti a-mitochondrie ti tene a sara si ala buba na lege ti mitophagie35,36,37. Na mbeni mbage, guengo na li ni ti kota ti mitochondrie alingbi ti gue oko na guengo na li ni ti biogénèse, so ayeke sala si akete mitocondrie so ayeke dü ayeke sigigi. Akota fission wala biogénèse ayeke fä ti mbeni kiringo tënë so ayeke kiri tënë ti bata mitose na gbele akpale ti mitochondrie. Ye oko, a lingbi ti zi pëpe so maïngo ti mitochondrie so ayeke kiri na peko, so fusion ni ayeke buba wala ambeni ye nde.
Atâa so a-image so ayeke na kota résolution so TEM aleke amû lege ti hinga mara ti aye so ayeke na yâ ti tere ti zo na ndo ti mitocondrie oko oko, kode so ayeke sara si a yeke wara a-image so ayeke na ambage use na mbeni ngoi oko. Ti manda ye na ndo ti akiringo tënë so ayeke na ngangu na ndo ti akpale ti métabolisme, a sara si a-mitochondrie aga TMRE na a sara kua na microscopie so ayeke mû ngoi mingi na lege ti analyse ti MEL, so amû lege ti bâ na lege ti 3D achangement so ayeke si na yâ ti réseau ti a-mitochondrie na yâ ti angoi nde nde33,38. A bâ so ambeni ye so ayeke polele pëpe me so ayeke kota mingi achangé na yâ ti mitochondrie na gbe ti ngangu ti PPA (Fig. 2). Na 3 mM, wungo ti aye so ayeke si na yâ ti fission ni ague na li ni mingi, me aye so ayeke si na yâ ti fusion ni angbâ gi tongaso tongana ti so a sara na yâ ti controle ni. A bâ so wungo ti aye so ayeke si na yâ ti fission nga na fusion ayeke gue na li ni na 5 mM PPA, me achangement so ayeke nduru ti lingbi tere, so afa so fission na fusion ayeke si na équilibre na yâ ti akota wungo (Fig. 2b). A yeke wara na yâ ti a-mitochondrie ni 3 nga na 5 mM PPA, so afa so a bata nzoni duti ti réseau ti a-mitochondrie ni (Fig. 2d). Ye so afa ngangu so aréseaux mitochondrie so ayeke na ngangu ayeke na ni ti kiri tënë na mbeni kete kpale ti métabolisme ti bata nzoni hôméostase sân ti tene aréseaux ni akangbi yâ ti terê ti zo. Na 3 mM PPA, guengo na li ni ti fission ni alingbi ti mû maboko ti tene zo ague na mbeni fini équilibre, me a hunda ti tene a leke yâ ti aye ni nzoni mingi ti kiri tënë na agingo bê so aga na lege ti akota wungo ti PPA.
Wungo ti amitocondrie ni ague na li ni na yâ ti abungbi use so kue ti PPA, me wungo ti amitochondrie ni ayeke changé mingi pëpe (Fig. 2c). Ye so alingbi ti si ngbanga ti so biogénèse ni ayeke gue na li ni wala kangbingo yâ ti aye ni ayeke gue na li ni; ye oko, tongana a yeke wara pëpe mbeni kota guengo na li ni ti wungo ti mitochondrie so ayeke na yâ ti mênë ti zo, a yeke ngangu pëpe ti tene biosynthèse ni ague na li ni. Me, asango so ayeke na yâ ti tableau 2 afa biani so ambeni ye use ayeke dä so ayeke sara si ye ni aga nzoni: wungo ti aye so ayeke si na yâ ti a-mitochondrie ayeke gue na li ni, so ague oko na upregulation ti fission ti mitochondrie, nga na wungo ti aye so ayeke si, so ague oko na biogénèse ti mitochondrie. Na nda ni, ngangu ti kiri na peko ti mbeni kete vundu alingbi ti duti na aye so ayeke si na oko ngoi so andu fission, fusion, biogénèse, na mitophagie. Atâa so awasungo mbeti kozoni afa so PPA ayeke sara si mitose30,39 nga na mitophagie29 akiri aga nzoni, a mû aye so afa so a lingbi a kiri a leke yâ ti fission ti mitochondrie nga na dynamique ti fusion ti kiri tënë na PPA. Asango so afa so achangement so ayeke na yâ ti tere ti zo so TEM abâ ayeke tâ tënë nga amû lege ti hinga ye mingi na ndo ti aye so ayeke sara si a-mitochondrie so ayeke na yâ ti tere ti zo ayeke sara kua nzoni pëpe.
Teti so gingo nda ti ye na lege ti TEM wala na lege ti MEL amû pëpe mbeni ye so afa biani so agene ayeke leke yâ ti aye so ayeke na gunda ti achangement so a bâ na yâ ti tere ti zo, a bâ lege so ARN ti agene so ayeke na yâ ti mitochondrie, biogénèse nga na dynamique ayeke fa na gigi. Proto-oncogène ti cMYC ayeke mbeni ye so ayeke sara si a-mitocondrie, a-glycolyse, a-acide aminé nga na a-acide gras ayeke sara kua nzoni40. Na ndo ni, a hinga so cMYC ayeke leke yâ ti agene ti mitochondrie ndulu na 600 so ayeke mû mbage na yâ ti kusala ti sungo peko ti atënë, ti kiringo peko ti atënë nga na ti bungbingo akota ye, so na popo ni a yeke wara NRF1 na TFAM41. NRF1 na TFAM ayeke akota ye use so ayeke leke yâ ti mitose, so ayeke sara kua na gbe ti PGC-1α ti sara si mtDNA abâ gigi. A yeke sara si lege so cAMP na AMPK ayeke sara kua na a yeke sara si zo ayeke sara kua nzoni nga na akpale ti métabolisme. A bâ nga NFE2L2, mbeni ye so ayeke sara si biogénèse ti mitochondrie abâ gigi, ti hinga wala a lingbi ti sara si PPA abâ gigi na lege ti stress oxidatif.
Atâa so NFE2L2 angbâ ti sara kua, a wara mbeni ye so ayeke sara si cMYC, NRF1 nga na TFAM adë na peko ti so a mû na ala ngbonga 24 ti sara kua na PPA 3 mM nga na 5 mM (Fig. 3a–c). A fa kozoni awe so salango si cMYC abâ gigi ayeke kiri tënë na kpale ti mitochondrie42, na mbage, salango kusala na cMYC alingbi ti sala si mitochondrie asala kusala nzoni pëpe na lege so a kiri a leke yâ ti mênë ti mitochondrie, abungbi ti réseau, na polarisation ti membrane43. Na lege ti fä, cMYC ayeke mû nga mbage na yâ ti lekengo yâ ti fission na fusion ti a-mitochondrie42,43 na a hinga so lo yeke sara si DRP1 akiri aga nzoni nga lo yeke sara si a-mitochondrie abâ gigi na ngoi so a yeke kangbi yâ ti acellule44, nga lo yeke sara si a-mitochondrie akiri aga nzoni na yâ ti a-neurone45. Biani, a-fibroblaste so ayeke na cMYC pëpe afa so kota ti mitochondrie ti ala adë, so ague oko na achangement so stress ti PPA43 ayeke sara. Asango so afa mbeni songo so apika bê me so ade ti si polele pëpe na popo ti cMYC na ngangu ti mitochondrie, na a mû mbeni ye so apika bê mingi teti amandango ye so ayeke ga na ndo lekengo tele ti zo na lege ti stress ti PPA.
A yeke wara na yâ ti NRF1 na TFAM kua so cMYC ayeke sara tongana mbeni kota ye so ayeke sara si a sû mbeti. Asango so ague nga oko na aye so a gi nda ni kozo awe na ndo ti acellule ti cancer ti colon ti zo so afa so PPA asara si mRNA ti NRF1 abâ gigi na yâ ti angbonga 22, ye so ayeke sara si ATP ayeke hunzi nga ROS46 ayeke gue na li ni. Azo so asû mbeti so afa nga so TFAM ayeke gue na li ni na yâ ti angbonga 8,5 me a kiri na place ni na yâ ti angbonga 22. Nde na so, Kim na amba ti lo. (2019) afa so mRNA ti TFAM ayeke kiri na peko mingi na peko ti so a sara 4 h ti PPA na yâ ti acellule ti SH-SY5Y; me na peko ti angbonga 72, a yeke wara gbâ ti aprotéine ti TFAM na a yeke sara si wungo ti acopie ti mtDNA akiri aga mingi. Tongaso, guengo na li ni ti wungo ti agene ti biogénèse ti mitochondrie so a bâ ni na peko ti angbonga 24 afa pëpe so guengo na li ni ti wungo ti mitochondrie ni ague oko na salango kusala ti biogénèse na ambeni ngoi so ahon. Azo so asara étude kozo afa so PPA ayeke sara si mRNA ti PGC-1α nga na protéine so ayeke na yâ ti acellule ti SH-SY5Y akiri aga nzoni mingi na yâ ti angbonga 4 na penze-ngbonga 30, na ngoi so acide propionique ayeke sara si biogénèse ti mitocondrie na yâ ti ahépatocyte ti amolenge ti ngombe akiri aga nzoni mingi na lege ti PGC-1α na yâ ti angbonga 12 na penze-ngbonga 39. Ye ti dongo bê ni ayeke so, PGC-1α ayeke pëpe gi mbeni ye so ayeke leke yâ ti NRF1 na TFAM, me a fa nga so lo yeke leke kusala ti MFN2 na DRP1 na lege so lo yeke leke yâ ti fission na fusion47. Tongana a mû ni kue, ye so afa so akota ye so ayeke leke yâ ti a-mitocondrie so ayeke sara kua na PPA ayeke sara kua maboko na maboko. Na ndo ni, asango ti e afa so akota ye so ayeke na yâ ti régulation ti transcription ti biogénèse nga na ti métabolisme ayeke na gbe ti ngangu ti PPA.
A yeke wara na yâ ti a-gene ti STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 na DRP1 akota ye so ayeke sara si a-mitochondrie abungbi, a-fusion nga na a-dynamique37,48,49. A yeke wara nga ambeni gene mingi so ayeke na yâ ti dynamique ti mitochondrie, me, a wara kozo awe so STOML2, OPA1 na MFN2 ayeke na méthylation nde nde na yâ ti agroupe ti ASD,16 na ambeni étude so ayeke nde afa so ambeni ye achangé na yâ ti a-facteur ti transcription so ti kiri tënë na stress ti mitochondrie50,5. 52. A yeke wara na yâ ti OPA1 na STOML2 akota ye so ayeke si na yâ ti tere ti zo na lege ti 3 mM na 5 mM ti PPA (Fig. 3e, f). OPA1 ayeke mbeni oko ti akota ye so ayeke leke yâ ti fusion ti a-mitochondrie na lege ti sarango kua mbilimbili na MFN1 nga na 2 nga lo yeke sara kua na yâ ti lekengo a-cristae nga na yâ lekengo a-mitochondrie53. A hinga pëpe mbilimbili kusala so STOML2 ayeke sala na yâ ti ngangu ti amitochondrie, me aye so afa so lo yeke sala kusala na yâ bungbingo ti amitochondrie, biogénèse, nga na mitophagie.
STOML2 ayeke mû mbage na yâ ti batango couplage ti pupu ti mitochondrie nga na lekengo abungbi ti chaîne ti pupu54,55 na a fa so lo yeke changé mingi asarango ye ti métabolisme ti acellule ti cancer56. Azo so asara étude afa so STOML2 ayeke sara si membrane ti mitocondrie ni ayeke sara kua nzoni nga ti sara biogénèse na lege ti sarango kua maboko na maboko na BAN nga na cardiolipine 55, 57, 58. Na ndo ni, ambeni étude so a sara ni nde afa so sarango kua maboko na maboko na popo ti STOML2 na PINK1 ayeke leke mitophagie59,60. Na lege ti fä, STOML2 a fa so lo yeke sala kusala mbilimbili na MFN2 na lo yeke sala nga kota kusala na yâ lekengo yongoro isoforme ti OPA1 na lege so lo yeke kanga lege na protease so ayeke na gunda ti bubango ti OPA153,61,62. A yeke na lege ni ti tene so STOML2 so ayeke na yâ ti aréaction ti PPA alingbi ti sara si aprotéine ti fusion so ayeke sara si a yeke ngangu pëpe ti buba na lege ti alege so abâ lege ti ubiquitin nga na proteasome48. Atâa so a hinga pëpe mbilimbili kusala ti STOML2 na OPA1 na yâ ti ngangu so PPA ayeke sara, tongana a sara si a-gene ti fusion so ayeke sara kua nzoni pëpe (Foto 3) a lingbi ti buba yâ ti équilibre so ayeke na popo ti fission na fusion na a sara si akota mitochondrie adë (Foto 3). 1).
Na mbage, a-protéine ti OPA1 angbâ lakue ti changé na peko ti ngbonga 24, na ngoi so mRNA nga na a-protéine ti MFN1, MFN2 wala DRP1 achangé mingi pëpe na peko ti so a mû na ala yorö ti PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Ye so alingbi ti fa so mbeni ye achangé pëpe na yâ ti lege so a yeke leke na aye so ayeke mû mbage na yâ ti fusion nga na fission ti mitochondrie. Ye oko, a yeke nzoni ti hinga so agene osio so oko oko kue ayeke nga na lege ti ambeni ye so ayeke changé na yâ ti tere ti zo (PTM) so ayeke bâ lege ti kusala ti aprotéine. OPA1 ayeke na ambeni lege osio ti bungbingo ye so a kangbi yâ ni na lege ti proteolytique na yâ ti a-mitochondrie ti sigigi na a-isoforme use so ayeke nde 63 . A yeke na lege ni ti tene so, na yâ ti angu so ahon, a yeke wara gbâ ti azo so ayeke sara kua ti OPA1 na yâ ti fusion ti a-mitocondrie nga na batango réseau ti a-isoforme64. A yeke sara kua na DRP1 na lege ti phosphorylation ti protéine kinase II (CaMKII) so ayeke sara kua na calcium/calmoduline, na a yeke sara si DRP1 abuba na lege ti ubiquitination nga na SUMOylation65. Na pekoni, DRP1 na MFN1/2 kue ayeke a-GTPase, tongaso kusala alingbi ti sala ngangu na ndo wungo ti GTP so ayeke sigigi na yâ ti a-mitochondrie 66 . Tongaso, atâa so fango peko ti aprotéine so angbâ lakue gi oko, ye so alingbi ti fa pëpe so kusala ti aprotéine wala ndo so ala yeke dä achangé pëpe67,68. Biani, mingi ni, arépertoire ti aprotéine ti PTM so ayeke dä ayeke sala kusala tongana kozo ye ti batango tele so ayeke na kungba ti sala si azo awara kpale ti bê. Na yâ ti tapande ti e, a yeke ngangu pëpe ti tene so PTM ayeke sara si a-protéine ti fusion na ti fission akiri aga nzoni mingi sân ti tene a hunda ti tene a kiri a sara kua na a-gene so na ndo ti mRNA wala na ndo ti a-protéine.
Tongana a bungbi asango so ayeke na nduzu ge afa so a yeke ngangu ti leke yâ ti mitochondrie nga na akpale so ayeke si ti fa nda ti aye so. Ti manda ye na ndo ti lege so agene ayeke sara kua na ni, a lingbi kozoni kue a hinga ambeni mbilimbili gene so ayeke na yâ ti lege ni. Ye oko, asango so e wara afa so agene so ayeke na yâ ti oko lege ni ayeke sara ye pëpe na oko lege na oko kpale so. Na yâ ti ambeni ye, a-étude so a sara kozo afa so agene nde nde so ayeke na yâ ti oko lege ni alingbi ti fa na gigi aprofil ti kiringo tënë ti ngoi nde nde30,46. Na ndo ni, ambeni ye ayeke dä so ayeke ngangu mingi ti sara na peko ti so a sû mbeti na yâ ti mbeni ye so ayeke buba yâ ti songo so ayeke na popo ti sungo mbeti nga na kusala ti agene. A-étude ti protéome alingbi ti mû lege ti hinga ye na ndo ti ngangu so a-PTM nga na kusala ti a-protéine ayeke sara na ndo ti zo, me a yeke ga nga na akpale so na popo ni a yeke wara akode so ayeke sara kua mingi pëpe, akota signal-à-bruit nga na asioni résolution.
Na yâ ti aye so, mandango ye na ndo ti lege so a-mitochondrie ayeke sara kua na TEM nga na MEL ayeke na ngangu mingi ti kiri tënë na akota hundango ndo na ndo ti songo so ayeke na popo ti ngangu ti a-mitochondrie nga na kusala ti ala nga tongana nyen la ye so ayeke sara ngangu na ndo ti kobela. Me ye so ayeke kota mingi ayeke so, TEM amû mbeni kode so ayeke mbilimbili ti mû mesure ti morphologie ti mitochondrie tongana mbeni ye so ayeke sara si a-mitochondrie ayeke sara kua nzoni pëpe51. MEL amû nga mbeni kode so ayeke mbilimbili ti bâ na lê ti zo aye so ayeke si na yâ ti mbeni ndo so ayeke na acellule so ayeke na ayanga ota, so amû lege ti hinga wungo ti aye so ayeke sara si a-mitocondrie ayeke kiri ti ga nzoni même tongana a changé pëpe na yâ ti sarango ye ti agene33. Na ndo so, a fa nzoni ti akode ti bango na image ti mitochondrie na yâ ti akobela ti mitochondrie so ayeke na pekoni. A yeke wara na yâ ti akobela so mingi ni mbeni kpale ti métabolisme so ayeke ngangu pëpe so ayeke sara si aréseaux ti mitochondrie ni akiri aga nzoni ahon ti tene a sara si a-mitochondrie ni abuba. Ye oko, mungo maboko ti mitochondrie so a hunda ti bata mitose na gbe ti akpale so ayeke ninga pëpe ayeke na akota ye ti pekoni na ndo kusala. Na yâ ti aye so andu senda-ye ti li, ti hinga nzoni mingi aye so ayeke sara si a-organe ti terê ti zo akiri aga nzoni alingbi ti mû akpengba sango na ndö ti kobela ti li so ayeke sara si a-mitochondrie ayeke sara kua nzoni pëpe.
Na nda ni, asango ti e afa nzoni ti akode ti bango na image ti hinga na aye so ayeke si na peko ti akota ye so ayeke si na popo ti fango peko ti agene, achangement so a yeke sara na yâ ti aprotéine nga na kusala ti aprotéine so ayeke bâ lege ti ngangu ti a-mitocondrie ti a-neurone. A sala kusala na PPA ti fa na gigi salango kusala ti mitochondrie na yâ ti mbeni model ti acellule ti neuron ti wara hingango ye na ndo mbage ti mitochondrie ti ASD. A-cellule ti SH-SY5Y so a sala kusala na PPA afa so ambeni ye achangé na yâ ti mitochondrie: a-mitochondrie aga kete na a yeke ronde, na a yeke fa nda ti a-cristae ni nzoni pëpe tongana a bâ ni na lege ti TEM. Azo so ayeke gi nda ti ye na lege ti MEL afa so achangement so ayeke si legeoko na mbeni guengo na li ni ti aye so ayeke si na yâ ti fission nga na fusion ti bata réseau ti mitochondrie ti kiri tënë na mbeni kete kpale ti métabolisme. Na ndo ni, PPA ayeke buba yâ ti aye mingi so ayeke sara si a-mitocondrie ayeke sara kua nzoni nga na hôméostase. A fa cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, na OPA1 tongana akota ye so ayeke leke yâ ti amitochondrie so a buba ni na lege ti stress ti PPA na alingbi ti sara mbeni kua ti sara si PPA asara si a changé yâ ti mitochondrie nga na kusala ti lo. A hunda ti tene a sara ambeni étude na yâ ti angoi so ayeke ga ti hinga nzoni mingi achangement so ayeke si na yâ ti ngoi so PPA ayeke sara na yâ ti fango peko ti agene nga na kusala ti aprotéine, ndo so zo ayeke dä nga na achangement so ayeke si na peko ti so a kiri pekoni. Asango ti e afa so akode ti lekengo ye so ayeke mû maboko na azo ti kiri tënë na akpale ti mitochondrie ayeke ngangu mingi nga ala yeke sara kua maboko na maboko nga afa so TEM nga na ambeni kode ti bango na image ayeke nzoni mingi ti sara na a-étude ti akode so ayeke na lege ni mingi.
A yeke wara na yâ ti mbeti ni ambeni ye so a iri ni SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL). A leke a-cellule ti SH-SY5Y na yâ ti mbeni ye so a leke ni na yâ ti mbeni ye so a iri ni Eagle so a leke ni nzoni (DMEM/F-12) nga na L-glutamine (SC09411, ScienCell) na yâ ti akete bozo so ayo 25 cm2 so a zia na yâ ni 20% ti sérum ti ngombe so ayeke na yâ ti mama (FBS9i11). na 1% ti pénicilline-stréptomycine (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) so ayeke na 37 °C, 5% ti CO2. A zia na yâ ti a-cellule ni mbeni ye so a iri ni 0,05% ti trypsine-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), so a zia na yâ ti centrifuge na 300 g na a zia ni na ndo ti mbeni plaque so wungo ni ayeke ndulu na 7 × 105 cellule/ml. A sara a-expérience kue na ndö ti a-cellule SH-SY5Y so ayeke nde pëpe na popo ti ambage 19–22. A yeke mû PPA tongana NaP. A yeke wara na yâ ti ngu ti MilliQ so wâ ayeke dä mingi, na a yeke bata ni na 4 °C. Na lango ti kaïngo kobela ni, a yeke mû PPA 1 M ti si na 3 mM nga na PPA 5 mM na yâ ti mbeni ye so ayeke na sérum pëpe (DMEM/F-12 so ayeke na L-glutamine). A yeke wara na yâ ti a-expérience ni kue PPA (0 mM, controle), 3 mM nga na 5 mM PPA. A sala a-expérience na yâ ti ambeni ye so a leke ni na lege ti biologie kamême ota.
A lu a-cellule ti SH-SY5Y na yâ ti akete bozo so ayo 25 cm5 na mbeni wungo ti a-cellule 5,5 × 105/ml na a kono yâ ni teti angbonga 24. A yeke wara na yâ ti bozo ni akode ti PPA kozoni si a zia ni na yâ ti ngbonga 24. A bungbi a-cellule ti pellets na lege ti a-protocole ti subculture ti anyama so ayeke na mama (so a fa ni na nduzu ge). A kiri a zia na yâ ti 100 μl ti glutaraldehyde 2,5%, 1× PBS na a bata ni na 4 °C juska a sara kua na ni. A zia na yâ ti a-cellule ti SH-SY5Y mbeni kete ngoi ti sara si a-cellule ni aga pellet na ti zi 2,5% ti glutaraldehyde, 1× solution ti PBS. A kiri a zia na yâ ti mbeni gel ti agarose so ayeke na 4% so a leke ni na yâ ti ngu so a distillé ni (bungbi ti agarose na wungo ti ngu ni ayeke 1:1). A zia akete kete ye ti agarose na ndo ti agrille na ndo ti aplaque so ayeke plat na a zia 1-hexadécène na ndo ni kozoni si a sara si a ga congélé. A zia a-échantillon ni na yâ ti acétone so ahule 100% na -90°C teti angbonga 24. Na pekoni, a zia wâ ni na -80°C na a zia na yâ ni mbeni ye so a sara ni na 1% ti tétroxyde d’osmium nga na 0,1% ti glutaraldehyde. A bata a-échantillon ni na -80°C teti angbonga 24. Na pekoni, a yeke sala si wâ ni ague na li ni yeke yeke ti si na ndowa ti chambre na yâ ti lango mingi: ti londo na – 80 °C ti si na – 50 °C teti angbonga 24, ti si na – 30 °C teti angbonga 24, ti si na – 10 °C teti angbonga 24 na nda ni ti si na ndowa ti chambre. zendo.
Na peko ti so a leke ni na lege ti cryogène, a zia na yâ ti a-échantillon ni résine na a sara ambeni mbage ni so ayeke ngangu mingi (∼100 nm) na lege ti mbeni ye so a iri ni Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). A mû ambage ni na 2% ti acétate ti uranyl nga na citrate ti plomb. A bâ ambeni ye na lege ti mbeni microscope ti électronique ti FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (so a iri ni kozo FEI), Eindhoven, Pays-Bas) so ayeke sara kua na 200 kV (mbeni ye ti fango na tënë ti Lab6) nga na mbeni caméra CCD ti Gatan (Gatan, Royaume-Uni) so ayeke na mbeni filtre ti ngangu ti Tridiem.
Na yâ ti a-image oko oko so a sara ni na lege ti senda-ye, a wara kamême a-image 24 ti mbeni cellule oko, so ti tene a-image ni kue ayeke 266. A bâ a-image ni kue na lege ti macro ti Région d’intérêt (ROI) nga na macro ti Mitochondrie. A yeke na lege ni ti tene e sara kua na akode so a sigigi na ni17,31,32 na a mû lege ti sara kua na a-image ti TEM na Fidji/ImageJ69. Na nduru tënë: a yeke kiri na image ni na peko na lege ti mbeni ye so a iri ni soutraction de fond de boule roulant (rayon ti pixel 60) nga na mbeni filtre ti bandpass FFT (so a sara kua na 60 na 8 pixel ti nduzu na ti gbe ni) nga na suppression ti ligne verticale so ayeke na mbeni tolérance ti orientation ti 5%. A yeke sara kua na image so a sara kua na ni ti sara kua na mbeni algorithme ti entropie so ayeke kota mingi nga a yeke sara si a yeke sara kua na mbeni masque binaire. A zi ambeni ndo ti image so ague oko na a-ROI so a soro ni na maboko na yâ ti a-image ti TEM so a leke ni pëpe, so afa mara ti mitocondrie na a zi na yâ ni membrane ti plasma nga na ambeni ndo so ayeke na kota kangbi. Ti ROI oko oko so a zi ni, a bâ akete kete ye use so akono ahon pixel 600, na a mû mesure ti ndo ti akete kete ye ni, périmètre ni, akota na akete axe ni, diamètre ti Feret, ronde ni nga na circulaire ni na lege ti akusala ti mesure so a leke ni na yâ ti Fiji/ImageJ. Na peko ti Merrill, Flippo, na Strack (2017), a sala kusala na asango so ti diko wungo ti ndo 2, ndo ti akete kete ye (kota na kete axe), nga na facteur ti forme (FF), so na yâ ni FF = périmètre 2/4pi x ndo. A lingbi ti wara nda ti formule ti paramètre na yâ ti mbeti ti Merrill, Flippo na Strack (2017). A-macro so a sara tënë ni ayeke na ndö ti GitHub (bâ Mbeti ti fango lege na asango). Na yâ ti mbeni moyenne, a gi nda ti akete kete ye ndulu na 5 600 na yâ ti mbeni yorö ti PPA, so ti tene wungo ti akete kete ye ndulu na 17 000 (a fa wungo ni pëpe).
A zia a-cellule ti SH-SH5Y na yâ ti a-appareil ti culture so ayeke na a-chambre 8 (ThermoFisher, #155411) ti tene a zia lege na adhésion na yâ ti bï oko na pekoni a zia ni na yâ ti TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) nga na Hoechst 33342 1:200 H200 (SigmaA-200). ti teinture. A mû a-image na lege ti laser ti 405 nm na ti 561 nm na yâ ti mbeni ndo so aninga penze-ngbonga 10, na a mû a-image so ayeke bruit tongana a-z-stack so ayeke na a-image 10 so ayeke na a-image ti az step ti 0,2 μm na popo ti a-image na a-image 12 so aga na pekoni . A mû a-image ni na lege ti mbeni plateforme ti Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 so ayeke na kota résolution (Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne) na lege ti mbeni objectif ti LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. A bâ a-image na yâ ti ImageJ na lege ti mbeni pipeline so a fa tënë ni kozo awe nga na plugin ti ImageJ ti mû mesure ti aye so asi na ngoi ti fusion na ti fission, wungo ti akete kete ye so ayeke na yâ ti a-mitocondrie nga na wungo ti a-mitocondrie so ayeke na yâ ti acellule oko oko33. A-macro ti MEL ayeke na ndo ti GitHub (bâ Mbeti ti warango asango).
A zia a-cellule ti SH-SY5Y na yâ ti aplaque so ayeke na adû omene na mbeni densité ti 0,3 × 106 cellule/mL teti angbonga 24 kozoni si a mû yorö ni. A zi ARN na lege ti protocole ti Quick-RNATM Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) na ambeni kete gbiango ye: a zia 300 μl ti tampon ti lyse ti ARN na yâ ti dû oko oko kozoni si a zi ni na a lyse échantillon oko oko tongana ndangba ye so a sara na 30 μl ti élution ti DNase/RNase. -ngu so ayeke senge senge. A bâ wungo ti a-échantillon ni kue nga na nzoni ni na lege ti mbeni spectrophotomètre UV-Vis NanoDrop ND-1000. A wara a-protéine kue so alondo na yâ ti a-lysate ti acellule na lege ti 200 μl ti tampon ti lyse ti RIPA, na a mû wungo ti a-protéine ni na lege ti test ti a-protéine ti Bradford70.
A sara kua na Kit ti lekengo na ADN ti TetroTM (BIO-65043, Méridian Bioscience) alingbi na afango lege ti azo so asara ni na ambeni ye so a changé ni. A leke cDNA na yâ ti aréaction ti 20-μl na lege ti 0,7 ti si na 1 μg ti ARN kue. A soro a-aprimeur na yâ ti ambeti so a sigigi na ni kozo awe 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tableau S1) na a leke a-aprimeur so ague oko na ni na lege ti gbakuru ti PrimerQuest so alondo na Integré ADN Technologies. A leke agene kue so ayeke na yâ ti gene ti nucléaire B2M. A yeke wara na yâ ti ambeti ti e ambeni ye so a iri ni STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC nga na OPA1. A yeke wara na yâ ti akota bungbi ni polymérase ti LUNA Taq (M3003L, Biolabs ti Nouvelle-Angleterre), a-aprimeur so ayeke gue na li ni nga na so ayeke kiri na peko 10 μM, ADNc nga na ngu so ayeke na grade ti PCR ti tene a wara mbeni ndangba wungo ti 10 μL ndali ti réaction oko oko. A yeke wara na yâ ti ambeti ti e ambeni ye so a iri ni TaqMan. A sara kua na mbeni ye so a iri ni Luna Universel qPCR Master Mix (M3004S, Biolabs ti Nouvelle-Angleterre) alingbi na afango lege ti azo so asara ni na a sara ambeni kete changement na yâ ni. A yeke wara na yâ ti a-étude ni 1X LUNA Taq polymérase, a-aprimeur ti gue na li ni na ti kiri na peko 10 μM, sonde 10 μM, cDNA nga na ngu so ayeke na grade ti PCR, na a sara si a yeke wara mbeni ndangba volume ti 20 μL ndali ti réaction oko oko. A sara kua na RT-qPCR na lege ti mbeni ye so a iri ni Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—numéro ti série: R0618110). A fa aye so asi na yâ ti Tableau S1. A mû a-échantillon ti ADN kue na yâ ti a-échantillon ota na a sara mbeni courbe standard na lege ti mbeni molongo ti a-échantillon so a sara ni fani bale-oko. Azo so ayeke na yâ ti a-échantillon ota so ayeke na déviation standard ti threshold ti cycle (Ct) >0,5, a zi ala na yâ ti analyse ni ti tene a lingbi ti kiri ti sara kua na asango30,72. A yeke wara na yâ ti a-étude ni kode ti 2-ΔΔCt79.
A mû ambeni échantillon ti protéine (60 μg) na a bungbi ni na tampon ti chargement ti Laemmli na mbeni ratio ti 2:1 na a sala kusala na ni na ndo mbeni gel ti protéine so ayeke na couleur pëpe so ayeke na 12% (Bio-Rad #1610184). A mû a-protéine na yâ ti mbeni membrane so a sara ni na PVDF (fluorure de polyvinylidène) (#170-84156, Bio-Rad) na lege ti mbeni ye so a iri ni Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). A kanga lege na membrane ni na a zia na yâ ti ni akozo ye so alingbi (OPA1, MFN1, MFN2, na DRP1) (so a dilué ni na 1:1000) teti angbonga 48, na pekoni a zia na yâ ni ambeni ye so alingbi na ni (1:10 000) teti ngbonga 1. Na pekoni, a mû a-image ti amembrane ni na lege ti mbeni ye so a iri ni Bio-Rad ChemiDoc MP. A sara kua na ImageLab version 6.1 ti sara na a-étude ti Western blot. A yeke wara na yâ ti tableau S1 akozo gel na blot. A yeke wara asango na ndo ti a-anticorps na yâ ti Tableau S2.
A fa abungbi ti asango tongana moyenne nga na erreur standard ti moyenne (SEM) ti a-échantillon ota so ayeke nde. A tara abungbi ti asango ti bâ wala a yeke na lege ni na lege ti test ti Shapiro-Wilks (tongana a fa mbeni ye nde pëpe) kozoni si a mû mbeni kangbingo ye ti Gaussien nga na a-écart standard so ayeke legeoko na a gue na li ni na a-analyse ni. Na ndo ti so a gi nda ti asango so a mû na lege ti MEL LSD ti Fisher (p < 0,05), ANOVA ti lege oko (moyenne ti traitement vs. contrôle), nga na test ti hakango ye mingi ti Dunnett ti hinga nene ti ye ni (p < 0,05). A yeke wara na yâ ti graphique ni akota p so ayeke *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. A sara kua na GraphPad Prism 9.4.0 ti sara na a-analyse ti statistique nga na agraphe kue.
A-macro ti Fiji/ImageJ ti gingo nda ti a-image ti TEM ayeke na ndo ti GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. A yeke wara na yâ ti GitHub macro ti gingo nda ti aye so ayeke si na yâ ti a-mitochondrie (MEL).
Meiliana A., Devi NM na Vijaya A. A-mitocondrie: akota zo so ayeke leke yâ ti terê ti zo, aye so ayeke sara si zo aduti nzoni, agingo bê, gango mbakoro nga na épigénétique. Indonésien. Biomédecine. J. 13, lembeti 221 ti si na 241 (2021).
Ben-Shachar, D. A yeke wara na yâ ti a-mitochondrie ni aye mingi so ayeke sara si zo ayeke na kobela ti li, complexe I tongana mbeni ye so alingbi ti sara si zo awara kobela. Kobela ti li. ye ti mungo maboko. 187, lembeti 3 ti si na 10 (ngu 2017).
Bose, A. na Beal, MF Azo so ayeke na kobela ti Parkinson ayeke sara kua nzoni pëpe. J. Neurochimie. 139, lembeti 216 ti si na 231 (ngu 2016).
Sharma VK, Singh TG na Mehta V. A-mitochondrie so ayeke na yâ ti kota vundu: a-objectif ti azo so ayeke na kobela ti Alzheimer. Mitochondrie 59, 48-57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF na Ferreira GK Mitocondrie na cerveau: bioénergie na ambeni ye nde. A yeke a-neurotoxine. ye ti mungo maboko. 36, lembeti 219 ti si na 238 (ngu 2019).
Rangaraju, V. na amba ti lo. Mitocondrie pléiotrope: ngangu so mitocondrie ayeke sara na ndo ti maïngo ti a-neurone nga na akobela. J. Senda-ye ti li. 39, lembeti 8200 ti si na 8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. na Morais, V. A. Biogénèse ti amitochondrie na yâ ti a-neurone: tongana nyen nga na ndo wa. ti kodoro wande. J. Mohr. na senda-ye. 22, ngu 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. na Zhao, J. Régulation ti dynamique ti mitochondrie ti anyama so ayeke na mama: alege nga na akpale. dawaan. ti endocrine. (Losanne) ngu 11, ngu 374 (2020).
Khacho, M. na Slack, RS Dynamique ti mitocondrie na yâ ti lekengo yâ ti cerveau ti zo: ti londo na cerveau so ayeke maï ti si na cerveau ti kota zo. maingoni. dynamique. 247, lembeti 47 ti si na 53 (ngu 2018).