Fadeso *Adresse ti fadeso: Cologne 50931, Allemagne, Cologne Groupe ti gingo nda ti ye na ndo ti kiringo tënë ti stress cellulaire na yâ ti akobela so andu gango mbakoro (CECAD).
Azo abâ so neurodégénérescence ti akobela ti mitochondrie ayeke ye so zo alingbi ti kiri na ni pëpe ndali ti so plasticité ti métabolisme ti a-neuron ayeke mingi pëpe, me a hinga pëpe ngangu so kpale ti mitochondrie ayeke sara na ndo ti autonomie ti acellule ti métabolisme ti a-neurone na yâ ti tere ti zo. Na ndo so, a yeke wara na yâ ti a-neuron ti Purkinje mbeni protéome so ayeke na yâ ti acellule so ayeke na kpale ti OXPHOS so ayeke gue na li ni ndali ti so a yeke sara si a-mitocondrie ayeke sara kua nzoni pëpe. A bâ so salango kusala nzoni pëpe ti mitochondrie asala si mbeni kota gbiango ye asi na yâ ti senda-ye ti protéomique, so na nda ni asala si a sala kusala na molongo ti ambilimbili programme ti salango ye ti tele kozoni si acellule ni akui. Na lege ti ndara, a yeke polele so a yeke wara na yâ ti pyruvate carboxylase (PCx) nga na ambeni enzyme so ayeke sara si zo aga mbakoro pëpe so ayeke mû maboko na a-intermédiaire ti cycle ti TCA. Ti kanga lege na PCx asara si stress oxidatif nga na dégénérescence ti li aga ngangu mingi, ye so afa so kobela ti athérosclérose ayeke bata a-neuron so ayeke na OXPHOS pëpe. Ti kiri ti bungbi a-mitochondrie na yâ ti a-neuron so abuba awe ayeke kiri na peko biani ti aye so ayeke sara si a-cellule ni akui pëpe. Ye so e wara afa alege so azo ahinga ni kozo pëpe so ayeke mû lege na zo ti gbu ngangu na gbele kpale ti mitochondrie nga afa so a lingbi ti kiri na peko ti neurodégénérescence même na yâ ti akota mbage ti kobela ni.
A yeke kota kusala ti mitochondrie na yâ batango ngangu ti a-neurone na lege ti akota ye so ayeke si na yâ ti li ti zo so ayeke na akobela ti mitochondrie ti zo. Mingi ti akobela so ayeke ga na lege ti achangement so ayeke si na yâ ti agene so ayeke sara si agene ti mitochondrie ayeke sara kua nzoni (1, 2) wala futingo ti agene so andu ngangu ti mitochondrie, so ayeke sara ngangu na ndo ti dutingo ti ADN ti mitochondrie (mtDNA) (3, 4). Kusala so a sala na ndo ti anyama afa so na kiringo tënë na kpale ti mitochondrie so ayeke na yâ ti anyama so angoro ni, a lingbi ti sala si alege ti salango ye ti tele so ayeke bata ye (5-7) asala kusala, so amû akpengba sango na ndo ti hingango ye so alï mingi na ndo lege so akobela so ayeke ngangu mingi ayeke sala. Nde mingi, hingango ye ti e na ndo ti achangement so ayeke si na yâ ti ambeni mara ti acellule so aga na lege ti kpale ti lekengo adénosine triphosphate (ATP) so ayeke na yâ ti cerveau ayeke kota ye mingi (8), na a gboto lê na ndo ti bezoin ti hinga akode ti kaïngo kobela so a lingbi ti sara kua na ni ti kanga lege wala ti kanga lege na kobela. Ti kanga lege na kobela ti li (9). Azo mingi abâ so a-cellule ti nerf ayeke na ngangu mingi pëpe ti sara ye tongana a haka ni na mara ti a-cellule so ayeke na yâ ti anyama so ayeke na terê ti ala (10). Na bango so acellule so ayeke sala kota kusala na yâ lekengo yâ ti mungo a-métabolite na a-neurone ti mû maboko na transmission ti synapse na ti kiri tënë na aye ti sioni nga na akobela, ngangu ti leke yâ ti a-cellule ti lingbi na akpale ti yâ ti cerveau ayeke gi na yâ ti a-cellule ti gliale ( 11-14 ). Na ndo ni, hétérogénité ti acellule so ayeke na yâ ti cerveau akanga lege mingi na mandango ye na ndo ti achangement so ayeke si na yâ ti ambeni mbilimbili kete groupe ti a-neurone. Ye so asara si a hinga ye mingi pëpe na ndo ti mbilimbili ye so ayeke si na peko ti so a-mitochondrie asara kua nzoni pëpe na yâ ti a-neurone.
Ti hinga ye so ayeke si na peko ti so a-mitochondrie asara kua nzoni pëpe, a zi a-neurone ti Purkinje (PN) na yâ ti ambage nde nde ti neurodégénérescence so aga na lege ti futingo ti fusion ti membrane ti gigi ti mitochondrie (Mfn2). Atâa so a yeke wara na yâ ti azo mbeni mara ti kobela ti héritier so a iri ni Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), futingo ti Mfn2 na yâ ti asusu ayeke mbeni ye so azo ahinga ni nzoni so ayeke sara si a yeke sara kua nzoni pëpe. Akete mara ti neuron nde nde (16-19) nga na akota ye so ayeke si na yâ ti li ti zo ayeke gue legeoko na ambeni ye so ayeke gue na li ni, na tapande kpale ti sarango ye (18, 19) wala ataxie ti cerveau (16). Na lege ti mbeni bungbi ti akode ti protéomique so ayeke na étiquette pëpe (LFQ), ti métabolisme, ti imagerie nga na ti akode ti gingo nda ti ye, a fa so neurodégénérescence so ayeke gue na li ni ayeke pusu ngangu pyruvate carboxylase (PCx) nga na ambeni ye so ayeke mû mbage na yâ ti artériosclérose ti PNs na yâ ti tere ti zo. Ti hinga wala ye so e wara so ayeke na lege ni, a sara si PCx so ayeke na yâ ti aPN so ayeke na Mfn2 pëpe aga kete, na a bâ so kusala so asara si stress oxidatif aga ngangu mingi nga asara si neurodégénérescence aga hio, na tongaso a fa so azoospermie ayeke mû lege na acellule ti kui ti sara ye alingbi na aye so ayeke na yâ ti terê ti zo. Akota fango na gigi ti MFN2 alingbi ti zi biani PN ti dégénérescence ti nda ni so ayeke na ngangu kpale ti OXPHOS, ti tengo mingi ADN ti mitochondrie, na na bango ni réseau ti mitochondrie so asuru, ye so afa nga so mara ti neurodégénérescence so alingbi même ti kiri ti wara ngangu na yâ ti akota mbage ti kobela ti cellule ti ngu.
Ti tene a bâ na lê ti zo a-mitochondrie so ayeke na yâ ti a-PN so a fâ yâ ti Mfn2, a sara kua na mbeni mara ti ngbo so amû lege na a-mitocondrie so ayeke na gbe ti Cre ti sara si a-mitochondrie so ayeke na yâ ti a-mitochondrie so ayeke na yâ ti a-mitochondrie (YFP) (mtYFP) (20) abâ gigi na a bâ lege so a-mitocondrie ni ayeke sara kua na ni na yâ ti tere ti zo. A bâ so futingo ti gene ti Mfn2 na yâ ti aPN ayeke sara si a yeke kangbi yâ ti réseau ti mitochondrie yeke yeke (Foto S1A), na a yeke wara kozo changement ni na ngoi so lo yeke na yenga 3. Nde na so, kota bubango ti couche ti acellule ti PN, tongana ti so a fa ni na lege ti futingo ti immunostaining ti Calbindin, ato nda ni pëpe juska na ngoi so lo yeke na yenga 12 (Foto 1, A na B). Ngoi so ague oko pëpe na popo ti akozo gbiango ye so ayeke si na yâ ti mitochondrie nga na tongo nda ti kuâ ti a-neurone so zo alingbi ti bâ ni apusu e ti gi nda ti achangement so ayeke si na yâ ti tere ti zo ndali ti so mitochondrie ayeke sara kua nzoni pëpe kozoni si acellule ni akui. A leke mbeni kode so a leke ni na lege ti fluorescence (FACS) ti kangbi yâ ti PN so ayeke fa YFP (YFP+) (Foto 1C), nga na yâ ti asusu so a bâ lege ti ala (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- arrêt-loxP: : L7-cre), so a iri ni na pekoni CT1BRL (Foto). A yeke nzoni e sara kua na akode ti gating so aluti na ndo ti ngangu ti fä ti YFP so amû lege na e ti sukula tere ti YFP+ (YFPhigh) ti PN so ayeke PN pëpe (YFPneg) (Foto S1B) wala akete mbage ti axon/dendrite so a tene a yeke fluorescent (YFPlow; Figure S1D, confopecal na mbage ti koli). Ti hinga mara ti azo so a kangbi yâ ti ala, a sara proteomique ti LFQ na pekoni a sara analyse ti akota composant, na a bâ so kangbi ayeke polele na popo ti acellule ti YFPhigh na ti YFPneg (Foto S1C). A-cellule ti YFPhigh afa so a yeke wara gbâ ti a-image ti PNs so a hinga ni (so ti tene Calb1, Pcp2, Grid2 na Itpr3) (21, 22), me a yeke wara pëpe gbâ ti a-protéine so a yeke fa ni mingi na yâ ti a-neuron wala ambeni mara ti acellule (Foto 1D) ). Mbeni hakango ye na popo ti a-échantillon na yâ ti a-échantillon ti YFPhigh so a bungbi ni na yâ ti a-expérience so a sara ni nde afa so mbeni coefficient ti corrélation ayeke dä> 0,9, so afa so a lingbi ti dü amolenge nzoni na popo ti a-réplique biologique (Foto S1E). Na nduru tënë, asango so afa so plan ti e ti sarango si PN so alingbi ti si aga nde aga tâ tënë. Ndali ti so système ti chauffeur ti L7-cre so a sara kua na ni ayeke sara si a yeke wara mosaïque na yâ ti kozo yenga na peko ti so a dü lo (23), a komanse ti fâ asusu so ayeke na yâ ti CTRL nga na a-neurone so ayeke na lege ni (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). Na peko ti so a leke ni awe, a iri ni Mfn2cKO na ngoi so lo yeke na yenga 4. Na nda ni, a soro yenga 8 ti ngu ti lo na ngoi so couche ti PN ni ayeke nzoni atâa so a yeke polele so a kangbi yâ ti mitochondrie ni (Foto 1B na Figure S1A). Na yâ ti aye kue, a wara wungo ti aprotéine 3013, so na popo ni ndulu na 22% aluti na ndo ti annotation ti MitoCarta 2.0 so aluti na ndo ti aprotéine ti mitochondrie tongana mitochondrie (Foto 1E) (Foto 1E) (24). A-analyse ti différentiel ti gene so a sara na yenga 8 afa so gi 10,5% ti a-protéine kue la ayeke na akota changement (Foto 1F na Figure S1F), so na popo ni a-protéine 195 ayeke na gbe ti régulation na a-protéine 120 ayeke na nduzu (Foto 1F). A yeke nzoni ti hinga so “fini lege ti gingo nda ti ye” ti bungbi ti asango so afa so agene so a fa ni na lege ti kangbi ayeke mingi ni ti mbeni bungbi ti ambeni mbilimbili lege ti salango ye ti tele so a kanga lege na ni (Foto 1G). A yeke ye ti dongo bê so, atâa so a yeke sara si alege so andu OXPHOS nga na signalisation ti calcium adë, a yeke sara si a-mitochondrie ayeke sara kua nzoni pëpe na yâ ti a-PN so ayeke na fusion pëpe, ambeni mara ti ye so ayeke kota mingi na yâ ti métabolisme ti acide aminé ayeke sara kua nzoni mingi, so ague oko na métabolisme so ayeke si na yâ ti a-aminocondrion P. ti sara kua nzoni pëpe.
(A) Afoto so a mû na lege ti confocal ti ambage ti cerveau ti asusu ti CTRL na ti Mfn2cKO so afa so PNs (calbindin, gris) ayeke gue na li ni; a yeke wara na yâ ti nucléaire ni DAPI. (B) Fango wungo ti (A) (analyse ti variance so ayeke na lege oko, ***P<0,001; n = 4 ti si na 6 ti cercle so alondo na asusu ota). (C) Salango kusala ti tara. (D) Carte ti chaleur ti kangbingo yâ ti amarque so ayeke mbilimbili ndali ti Purkinje (na nduzu) nga na ambeni mara ti acellule (na milieu). (E) Diagramme ti Venn so afa wungo ti aprotéine ti mitocondrie so a wara na yâ ti PN so a kangbi yâ ni. (F) Volcan plot ti aprotéine so a fa ni na lege nde nde na yâ ti a-neuron ti Mfn2cKO na yenga 8 (valeur ti kongo ti kota ye ni ayeke 1,3). (G) Analyse ti lege ti création afa akota lege oku ti régulation ti gue na li ni (rouge) na ti régulation ti gbe ni (bleu) na yâ ti Mfn2cKO PN so a diko ni na yâ ti ayenga 8. A fa nivo ti fango ye ti poroso oko oko so a wara. Carte ti chaleur ti gris: ngere ti P so a leke ni. ns, kota ye pëpe.
Atondo ti protéomique afa so yeke yeke aprotéine so ayeke na yâ ti acomplexe I, III nga na IV ayeke kiri na peko. A-complexe I, III, na IV kue ayeke na akete kete ye so ayeke kota ye mingi so a zia code na ndo ni na mtDNA, me complexe II, so ayeke gi na code ti nucléaire, ayeke na kota ye pëpe (Foto 2A na Tapande S2A). . Na lege ti aye so asi na yâ ti protéomique, immunohistochimie ti ambage ti tere ti cerveau afa so MTCO1 (sous-unité 1 ti cytochrome C oxidase ti mitochondrie) so ayeke na yâ ti complexe IV na yâ ti PN ayeke kiri na peko yeke yeke (Foto 2B). A yeke wara na yâ ti mtDNA ni mbeni kete mbage ti Mtatp8 so ayeke na yâ ti mtDNA (Foto S2A), na ngoi so nivo ti stable ti ATP synthase so ayeke na yâ ti nucléaire angbâ gï tongaso, ye so ague oko na complexe F1 so a hinga ni so ayeke stable ti ATP synthase so ayeke stable na ngoi so mtDNA ayeke stable. Formation ni ayeke gue oko. Zia yanga ti lo (7). Na ngoi so a bâ nivo ti mtDNA na yâ ti a-PN ti Mfn2cKO so a soro ni na lege ti réaction en chaîne de polymérase en temps réel (qPCR), a fa so wungo ti akopi ti mtDNA ayeke kiri na peko yeke yeke. Tongana a haka ni na groupe ti azo so abâ lege ti ala, na ngoi so ala yeke na yenga 8, gi ndulu na 20% ti mtDNA ni la angbâ (Foto 2C). Na lege ti aye so asi, a sala kusala na microscope confocal ti Mfn2cKO PNs ti hinga na ADN, so afa so a yeke sala kusala na a-nucléotide ti mitochondrie so abâ ngoi (Foto 2D). A bâ so gi ambeni candidat so ayeke mû mbage na yâ ti bubango ti aprotéine ti mitochondrie nga na kiringo tënë na akpale ti bê la ayeke na lege ni, so na popo ni a yeke wara Lonp1, Afg3l2 na Clpx, nga na akota ye so ayeke sara si abungbi azo. A yeke wara pëpe mbeni kota gbiango ye na yâ ti wungo ti aprotéine so ayeke na yâ ti apoptose (Foto S2B). Legeoko nga, a bâ so a-mitocondrie nga na a-réticulum endoplasmique so ayeke mû mbage na yâ ti mungo calcium ayeke gi na akete ye so achangé (Foto S2C). Na ndo ni, gingo nda ti ye na ndo ti aprotéine so andu autophagie awara pëpe mbeni kota gbiango ye, so ague oko na bango ndo ti azo so ayeke na yâ ti a-autophagosome so a bâ ni na yâ ti tere ti ala na lege ti immunohistochimie nga na microscopie électronique (Foto S3). Me, kpale ti OXPHOS so ayeke gue na li ni na yâ ti aPN ayeke gue oko na achangement so ayeke polele na yâ ti a-mitochondrie so ayeke na yâ ti a-ultrastructure. A lingbi ti bâ abungbi ti mitochondrie na yâ ti tere ti acellule nga na akeke ti dendrite ti Mfn2cKO PN so ayeke na ngu 5 na 8, na a leke yâ ti membrane ti yâ ni ti sara akota changement (Foto S4, A na B). Na lege ti achangement so ayeke na yâ ti ultrastructure so nga na mbeni kota guengo na li ni ti mtDNA, gingo nda ti akete kete ye so ayeke na yâ ti cerveau ti zo so ayeke na éster ti méthyle ti tétraméthylrhodamine (TMRM) afa so ngangu ti membrane ti mitochondrie so ayeke na yâ ti aPN ti Mfn2cKO ayeke kiri na peko mingi (Foto S4C).
(A) A yeke na lege ni ti tene e sara kua na nivo ti fango tënë ti OXPHOS. A yeke gi aprotéine so ayeke na P<0,05 na yâ ti ayenga 8 (ANOVA so ayeke na alege use). Ligne ti point: A yeke sara mbeni changement pëpe tongana a haka ni na CTRL. (B) Na mbage ti koli: Mbeni tapande ti mbeni mbage ti cerveau so a sû na ndo ni mbeni ye so ayeke tiri na MTCO1 (barre d’échelle, 20 μm). Ndo so acellule ti Purkinje ayeke dä ayeke na jaune. Na mbage ti koli: Fango wungo ti MTCO1 (analyse ti variance so ayeke na lege oko; n = 7 ti si na 20 cellule so a gi nda ni na lege ti asusu ota). (C) qPCR ti gi nda ti wungo ti copie ti mtDNA na yâ ti PN so a soro ni (gingo nda ti ye na lege oko ti variance; n = 3 ti si na 7 ti asusu). (D) Na mbage ti koli: Mbeni tapande ti mbeni mbage ti cerveau so a sû na ndo ni mbeni ye so ayeke tiri na ADN (barre ti échelle, 20 μm). Ndo so acellule ti Purkinje ayeke dä ayeke na jaune. Na mbage ti koli: Diko wungo ti asioni ye so ayeke na yâ ti mtDNA (analyse ti variance so ayeke na lege oko; n = 5 ti si na 9 ti acellule so alondo na asusu ota). (E) Mbeni tapande ti mbeni mbage ti cerveau so ayeke ngangu mingi so afa acellule ti mitoYFP + Purkinje (flèche) na yâ ti mbeni enregistrement ti pince ti patch ti acellule kue. (F) Fango wungo ti courbe ti IV. (G) A-enregistrement so afa so a zia na yâ ti acellule ti Purkinje ti CTRL na ti Mfn2cKO. Top trace: Kozo pulse so asara si AP abâ gigi. Trace ti gbe ni: Fréquence ti AP so ayeke maximum. (H) Fango wungo ti aye so ayeke si na yâ ti tere ti zo (sPSPs). A fa trace ti enregistrement ti représentant ni nga na ratio ti zoom ti lo na (I). A yeke na lege ni ti tene a bâ n = 5 ti si na 20 ti acellule so alondo na yâ ti asusu ota. A fa asango ni tongana moyenne±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) A-trace ti AP so ayeke spontané so a enregistré ni na lege ti mode ti pince ti perforé. Top trace: Fréquence ti AP so ayeke kota mingi. Trace ti gbe ni: zoom ti mbeni AP oko. (K) Fa wungo ti moyenne na maximum ti fréquence ti AP alingbi na (J). tara ti Mann-Whitney; n = 5 acellule so a mû na yâ ti asusu osio. A fa asango ni tongana moyenne±SEM; kota ye pëpe.
A bâ polele so OXPHOS abuba yâ ti Mfn2cKO PN so ayeke na yenga 8, so afa so kusala ti physiologique ti a-neuron ayeke tâ na lege ni pëpe. Tongaso, a yeke nzoni ti tene e sara kua na a-électricité so ayeke na yâ ti a-neurone so ayeke na OXPHOS pëpe na yâ ti ayenga 4 ti si na 5 nga na ayenga 7 ti si na 8 na lege so a sara enregistrement ti a-électrode ti cellule kue na yâ ti akete kete cerveau (Foto 2E). Na lege ti fä, moyen ti ngangu ti membrane ti wungo tere nga na ngangu ti lïngo na yâ ti a-neurone ti Mfn2cKO ayeke legeoko na ti azo so abâ lege ti ala, atâa so ambeni kete kangbi ayeke na popo ti acellule ni (Tableau 1). Legeoko nga, na ngoi so lo yeke na yenga 4 ti si na 5, a wara pëpe mbeni kota gbiango ye na yâ ti songo so ayeke na popo ti courant na tension (courbe IV) (Foto 2F). Me, mbeni neuron ti Mfn2cKO so ayeke na yenga 7 ti si na 8 asö kuâ pëpe na yâ ti yorö ti IV (étape ti hyperpolarisation), so afa so mbeni ye so ayeke polele so ayeke sara si zo alingbi ti sara kua na hyperpolarisation na yâ ti ngoi so. Na yâ ti ambeni ye, na yâ ti a-neuron ti Mfn2cKO, a yeke wara a-courant dépolarisant so ayeke sara si a-action potentiel (AP) asigigi nzoni, so afa so alege ti sigingo ti ala kue ayeke nde mingi pëpe na ti a-neuron ti komande so ayeke na yenga 8 (Tableau 1 na Figure 2G). Legeoko nga, wungo ti akota ye so ayeke si na yâ ti tere ti zo (sPSC) alingbi na ti azo ti groupe ti azo so abâ lege ti ala, na wungo ti aye so asi so alondo na yenga 4 ti si na yenga 5 ti si na yenga 7 ti si na yenga 8 na mara ti guengo na li ni tongaso (Foto 2, H na I). Ngoi ti maïngo ti synapse na yâ ti PNs (25). A wara mara ti ye tongaso na peko ti so a zia na yâ ti a-appareil ti PN so a perforé ni. A leke ye so ti kanga lege na lege so a lingbi ti leke na asioni ye so ayeke na yâ ti ATP ti acellule, tongana ti so alingbi ti si na yâ ti enregistrement ti pince ti patch ti acellule kue. Na yâ ti ambeni ye, a yeke wara ngangu ti membrane ti wungo tere nga na fréquence ti futingo ti spontané ti a-neurone ti Mfn2cKO (Foto 2, J na K). Na nduru tënë, aye so asi afa so a-PN so ayeke na mbeni kpale ti OXPHOS so ayeke polele alingbi ti gbu ngangu na gbele akota fréquence ti décharge nzoni, so afa so mbeni kode ti compensation ayeke dä so amû lege na ala ti bata akiringo tënë ti électrophysiologique so ayeke ndulu na normale.
A fa asango ni tongana moyenne ± SEM (analyse ti variance so ayeke na lege oko, test ti Holm-Sidak ti hakango ye mingi; *P<0,05). A fa numéro ti unité ni na lege ti crochet.
A leke ti gi ti hinga wala mbeni mara ti ye na yâ ti bungbi ti asango ti proteomique (Foto 1G) ayeke na alege so alingbi ti kanga lege na ngangu kpale ti OXPHOS, tongaso ti fa ngbanga ti nyen PN so asala ngangu na ndo ni alingbi ti bata électrophysiologie so ayeke ndulu na normale (Foto 2, E ti si na K). . Azo so abâ lege ti protéomique afa so a-enzyme so ayeke na yâ ti catabolisme ti a-acide aminé so ayeke na a-branché (BCAA) ayeke sara si a-acide aminé so ayeke na yâ ti a-artériosclérose (Foto 3A na S5A) aga nzoni mingi (Foto 3A na Foto S5A), na ndangba ye so a yeke sara na acétyl-CoA (CoA) wala succinyl CoA alingbi ti mû maboko na a-tricarboxylate so ayeke na yâ ti artériosclérose (artériosclérose). A bâ so wungo ti BCAA so ayeke na yâ ti mênë ti zo (BCAT1) nga na BCAT2 ayeke gue na li ni. Ala yeke sara si kozo ye so ayeke na yâ ti BCAA abâ gigi na lege so ala yeke sara si glutamate alondo na yâ ti α-cétoglutarate (26). A yeke wara na yâ ti a-unité kue so ayeke na yâ ti groupe ti acide keto acide déhydrogénase (BCKD) so ayeke na yâ ti chaîne branchée (complexe ni ayeke sara si a-élément ti carbone ti BCAA so ayeke na yâ ti chaîne ti branché ni aga nzoni) (Foto 3A na Figure S5A). Me, a wara pëpe mbeni ye so ayeke polele so achangé na yâ ti BCAA ni wani na yâ ti PN so a soro ni, so alingbi ti si ndali ti so a-acide aminé so ayeke kota ye mingi na yâ ti acellule wala a sara kua na ambeni ye nde (glucose wala acide lactique) ti mû maboko na cycle ti TCA (Foto S5B). A-PN so ayeke na OXPHOS pëpe afa nga so ala yeke sara kua ti futingo ti glutamine nga na ti sarango si a-enzyme ti ala aga nzoni mingi na ngoi so ala yeke na yenga 8, ye so alingbi ti si na lege ti sarango si a-enzyme ti mitocondrie so ayeke na yâ ti a-enzyme so ayeke na yâ ti a-enzyme so ayeke na yâ ti a-mitocondrie (GPT2) ague na li ni (Foto 3, A na C). A yeke nzoni ti hinga so a yeke wara na yâ ti a-isoforme ti glutaminase C (GLS-GAC) (changement ti Mfn2cKO/CTRL ayeke ndulu na fani 4,5, P = 0,05), na a yeke wara na yâ ti a-tissue ti bio ti cancer so a lingbi ti mû maboko na a-mitochondrie. (27).
(A) Carte ti chaleur ni afa changement so ayeke na yâ ti nivo ti protéine ndali ti lege so a fa ni na yâ ti ayenga 8. (B) Tapande ti mbeni mbage ti cerveau so a sû na ndo ni mbeni ye so ayeke tiri na PCx (barre ti échelle, 20 μm). Flèche jaune ni afa tere ti cellule ti Purkinje. (C) A yeke na lege ni ti tene e sara kua na a-athérosclérose (t-test mingi, *FDR <5%; n = 3-5 souris). (D) Na nduzu ge: Mbeni fä so afa alege nde nde ti lï na yâ ti carbone so a zia marque na ndo ni so ayeke na yâ ti traceur ti pyruvate [1-13C] (so ti tene, na lege ti PDH wala na lege ti trans-artérielle). Na gbe ni: Tableau ti violon ni afa wungo ti carbone so a zia marque oko na ndo ni (M1) so a gbian ni ti ga acide aspartique, acide citrique nga na acide malique na peko ti so a zia marque na ndo ti akete kete mbage ti cerveau so ayeke ngangu mingi na [1-13C]pyruvate (t-test use; ** P <0,01). (E) A yeke gi nda ti mbaï ti ngoi ti lege so a fa. A yeke gi aprotéine so ayeke na P<0.05 na yâ ti ayenga 8 . Ligne tracée: ngere ti lekengo ye ayeke dä pëpe (analyse ti variance na lege use; * P <0,05; *** P <0,001). A fa asango ni tongana moyenne±SEM.
Na yâ ti gingo nda ti ye ti e, BCAA catabolism aga mbeni oko ti akota lege ti lekengo ye. Ye so afa ngangu so wungo ti pupu so ayeke lï na yâ ti cycle ti TCA alingbi ti changé na yâ ti PN so ayeke na OXPHOS pëpe. Ye so alingbi ti duti mbeni kota mara ti kiringo na peko ti aye so ayeke na yâ ti a-neurone, so alingbi ti sara ngangu na ndo ti physiologie ti a-neurone nga na fini ti ala na ngoi so a yeke bata ngangu kpale ti OXPHOS. Na lege ti tënë so, a bâ so kota enzyme so ayeke tiri na a-athérosclérose PCx ayeke na yâ ti mênë ti zo (Mfn2cKO/CTRL achangé fani 1,5 tongaso; Tapande 3A), so ayeke sara si pyruvate aga oxaloacétate (28), so a mä ​​na bê so a yeke na yâ ti brabrain, so a iri ni tostrocyte). 30). Na lege ti aye so asi na yâ ti proteomique, microscope confocal afa so PCx ayeke mbilimbili na yâ ti aPN so ayeke na OXPHOS pëpe, na ngoi so PCx ayeke sara kua mingi na yâ ti acellule ti glial ti Bergmann so ayeke na terê ti azo so abâ lege ti ala (Foto 3B). Ti tara ti bâ wala PCx ayeke sara kua nzoni, a sara kua na akete kete cerveau so ayeke na yâ ti cerveau ti zo so ayeke na [1-13C]pyruvate tracer. Na ngoi so a yeke sara si pyruvate ni aga oxidé na lege ti pyruvate déhydrogénase (PDH), isotope ti lo abuba , Me a yeke zia na yâ ti a-intermédiaire ti cycle ti TCA na ngoi so a yeke sara si pyruvate ni aga oxidé na lege ti aréaction ti mênë (Foto 3D). Na mungo maboko na asango ti proteomique ti e, a bâ gbâ ti a-marqueur so alondo na traceur so na yâ ti acide aspartique ti akete kete ye ti Mfn2cKO, na ngoi so acide citrique na acide malique ayeke nga na mbeni tendance so ayeke na popo ni, atâa so a yeke kota ye pëpe (Foto 3D).
Na yâ ti a-neuron ti dopamine ti asusu ti MitoPark so ayeke na kpale ti mitochondrie so asara si a-neuron ti dopamine ni ayeke buba mbilimbili gene ti facteur ti transcription ti mitochondrie (Tfam) (Foto S6B), a yeke wara nga PCx so ayeke sara si a-acétone ni ayeke sara kua nzoni pëpe (31), so afa so acide acétone so ayeke sara si a-artériosclérose ti zo ni ayeke sara kua nzoni pëpe. OXPHOS na yâ ti tere ti zo. A yeke nzoni ti hinga so a bâ so ambeni enzyme so ayeke nde (32-34) so ​​alingbi ti sigigi na yâ ti a-neuron so alingbi ti sara si a-artériosclérose abâ gigi ayeke sara si a-PN so ayeke na OXPHOS pëpe ayeke gue na li ni mingi, na tapande a-enzyme so ayeke sara si propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA so ayeke changé propionyl-CoA ti ga . enzyme 3 (ME3), so kota kusala ti lo ayeke ti wara pyruvate na yâ ti malate (Foto 3, A na C) (33, 35). Na ndo ni, a wara mbeni kota guengo na li ni ti enzyme Pdk3, so ayeke phosphorylé na tongaso ti sara si PDH asara kua pëpe (36), na ngoi so a bâ pëpe mbeni ye so achangé na yâ ti enzyme ti Pdp1 so ayeke sara si PDH asara kua wala na yâ ti enzyme ti PDH ni wani (Foto 3A). Na lege ti fä, na yâ ti aPN ti Mern2cKO, a yeke sara si a yeke ngangu pëpe ti tene a sara kua na α1 (PDHE1α) so ayeke na yâ ti pyruvate déhydrogénase E1 so ayeke na yâ ti PDH so ayeke na yâ ti Ser293 (so a hinga ni ti kanga lege na kusala ti enzyme ti PDH) ( Tapande S6C ) ( Tapande S6C ). Pyruvate ayeke na lege ti mênë pëpe.
Na pekoni, a bâ so super lege ti biosynthèse ti sérine na ti glycine, cycle ti folate (1C) ti mitochondrie so ague oko na ni nga na biosynthèse ti proline (Foto 1G na Figure S5C) kue ayeke na kota lege ti gue na li ni, a lingbi na ambeni tondo, na ngoi ti kusala ti salango kusala na ni. A yeke sara si anyama so ayeke na terê ti e ayeke sara kua nzoni pëpe (5-7). A-analyse confocale so amû maboko na asango ti protéomique so afa so na yâ ti PN so OXPHOS ayeke dä pëpe, a mû na akete kete mbage ti cerveau ti asusu so ayeke na ngu 8 mbeni ye so a iri ni sérine hydroxyméthyltransférase 2 (SHMT2), so ayeke mbeni kota enzyme so ayeke na yâ ti cycle ti folate ti mitochondrie. A yeke kota ye ti tene e sara ye (Foto S5D). Na yâ ti akete kete ye 13 so a sara na CU-glucose, a-expérience ti traçage ti métabolisme afa nga so biosynthèse ti sérine na ti proline ayeke gue na li ni, so afa so wungo ti a-isoforme ti carbone so ayeke na yâ ti sérine na ti proline ayeke gue na li ni (Foto S5E). Teti so aréaction so GLS na GPT2 ayeke sara si a yeke wara glutamate na yâ ti glutamine nga na transamination so ayeke na popo ti glutamate na α-kétoglutarate, a-upregulation ti ala afa so a-neurone so ayeke na OXPHOS pëpe ayeke na mbeni kota hundango ye ti glutamate , Ye so alingbi ti sara si a bata biosynthèse ti prouréline so akono (Fig5). Na yâ ti ambeni ye, a yeke wara a-astrocyte ti cerveau so alondo na asusu ti Mfn2cKO so ayeke na PN afa so alege so (so na popo ni a yeke wara a-antiperoxydase kue) achangé mingi pëpe na yâ ti sarango ye ti ala, na tongaso a fa so rédirection métabolique so ayeke soro ti sara si PN so abuba aga D na G (Fig. S6).
Na nduru tënë, a-analyse so afa so a yeke wara gbâ ti alege nde nde ti sarango kua na ambeni mbilimbili lege ti sarango ye ti terê na yâ ti a-PN. Atâa so kusala ti mitochondrie ti a-neurone so ayeke na lege ni pëpe alingbi ti sara si a-athérosclérose ti mênë ti zo ason hio nga ti leke yâ ti 1C (Foto 3E na Figure S5C), nga même achangement so a lingbi ti fa ni kozo awe na yâ ti sarango ye ti a-complexe I na IV, achangement so ayeke si na yâ ti synthèse ti serine de novo ayeke gi Lo ga polele na yâ ti stage ti nda ni. OXPHOS ayeke sara kua nzoni pëpe (Foto 3E na Foto S5C). Azo so abâ ye so afa mbeni ye so ayeke si na peko ti tele so na yâ ni a-mitocondrie (cycle 1C) nga na a-cytoplasme (biosynthèse ti sérine) so asala si zo ayeke na kota vundu ayeke sala kusala maboko na maboko na guengo na li ni ti a-athérosclérose na yâ ti cycle ti TCA ti kiri ti leke yâ ti aye so ayeke na yâ ti a-neurone.
A-PN so ayeke na OXPHOS pëpe so ayeke na yenga 8 alingbi ti bata kusala ti salango ye ti ala so ayeke na kota fréquence na ti sala mbeni kota reconnexion métabolique ti leke na kpale ti mitochondrie. Ye so ala wara so asala si mbeni ye ti dongo bê alondo so même na ngoi so, acellule so alingbi nga ti wara yorö ti kaïngo wala ti kanga lege na kobela ti li. Ga na peko. E leke kpale so na lege ti ambeni ye use so azo asara ni nde. Na yâ ti kozo kode ni, a leke mbeni vecteur ti virus so ayeke na yâ ti adéno-associé (AAV) so abâ lege ti Cre tongaso si a lingbi ti soro ti fa MFN2 na yâ ti aPN so ayeke na OXPHOS pëpe na yâ ti tere ti zo (Foto S7A). AAV so ayeke codé MFN2 nga na gene ti fango tënë ti fluorescent mCherry (Mfn2-AAV) a bâ ni na yâ ti akozo culture ti neuron na yâ ti a-in vitro, ye so asara si MFN2 asigigi na mbeni lege so abâ lege ti Cre na a zingo lege na a-mitocondrie ti sara ye, tongaso a kanga lege na a-neuromutation ti Mfn, B Figure S7). Na pekoni, a sara a-expérience in vivo ti mû na lege ti stéréotactique Mfn2-AAV so ayeke na ngu 8 na yâ ti cerveau ti Mfn2cKO nga na asusu so a bâ lege ti ala, na a gi nda ti asusu so ayeke na ngu 12 (Foto 4A). Azo so asala kusala na Mfn2cKO akui (Foto 1, A na B) (16). A yeke na lege ni ti tene so PN ayeke na yâ ti ambeni cercle ti cerveau (Foto S7, G na H). Na pekoni, lo mû na ala mbeni yorö so a iri ni AAV so ayeke fa gi mCherry (Ctrl-AAV) ti sara si anyama so ayeke na Mfn2cKO abâ gigi. Na yâ ti ambeni ye, a yeke wara na yâ ti Mfn2cKOs so a sara kua na Mfn2-AAV ti bata na couche ti acellule ti PN (Foto 4, B na C). Mingi ni, a yeke mo bâ mo tene a yeke ngangu ti kangbi popo ti wungo ti a-neurone na anyama so a bâ lege ti ala (Foto 4, B na C, nga na Foto S7, H na I). A yeke na lege ni ti tene so MFN1 me pëpe MFN2 ayeke sara kua nzoni ti bata kuâ ti a-neurone (Foto 4C na Figure S7, C na F), so afa so MFN1 so ayeke na yâ ti ectopique alingbi ti mû maboko nzoni na azo so ayeke na MFN2 pëpe. Azo so abâ ni na yâ ti PN oko afa so Mfn2-AAV asö fini ti azo mingi na yâ ti ultrastructure ti mitocondrie, a sara si mtDNA aga normale nga a kiri na peko ti gango ti PCx so ayeke sara si a-angiogénèse abâ gigi (Foto 4, C ti si na E ). Tongana a bâ na lê ti azo asusu ti Mfn2cKO so a zi ala na yâ ti mbeni dutingo ti wungo tere, a bâ so dutingo ti ala nga na akode ti sarango ye ti ala (mouvement S1 ti si na S3) aga nzoni. Na pekoni, a-expérience so afa so ti kiri ti zia MFN2 na yâ ti a-PN so ayeke na OXPHOS mingi pëpe alingbi awe ti kiri na peko ti tengo mtDNA na ti sara si a-athérosclérose abâ gigi, tongaso a yeke kanga lege na bubango ti axon nga na kuâ ti a-neurone na yâ ti tere ti zo.
(A) Mbeni fä so afa programme ti tara ti ziango na yâ ti zo AAV so ayeke codé MFN2 na ngoi so a sara kua na lege ti métabolisme so a fa ni. (B) A-image ti confocal so afa na gigi akete kete cerebelle so ayeke na yenga 12 so a sala kusala na ni na yenga 8 na yâ ti asusu ti Mfn2cKO na a zia marque na ndo ni na mbeni ye so ayeke tiri na Calbindin. Na mbage ti koli: A yeke wara na yâ ti a-axon. A yeke wara na yâ ti a-axon ni 450 na 75 μm. (C) Na mbage ti koli: Diko wungo ti acellule ti Purkinje na yâ ti boucle ti transduction ti AAV (AAV+) (analyse ti variance so ayeke na lege oko; n = 3 asusu). Na mbage ti koli: mtDNA focus analyse na yâ ti PN so a transduire ni na yenga 12 (t-test so ayeke na couple pëpe; n = 6 cellules so alondo na asusu ota). * P <0,05; ** P <0,01. (D) A yeke wara na yâ ti a-électronique ti PN ti ambage ti cerveau ti Mfn2cKO so a sara kua na a-vecteur ti virus so a fa ni. Masque ti rose ni afa ndo so a-dendrite ayeke dä, na carré so ayeke na akete point jaune afa zoom so a mû na mbage ti koli; n ayeke fä ti nucléaire. Barre ti échelle, 1μm. (E) afa mbeni tapande ti PCx so a zia na yâ ti PN so a sara ni na yenga 12. Barre ti échelle, 20μm. OE, salango tënë ahon ndo ni; FC, pli ti changé.
Na pekoni, a gi nda ti nene ti tene a-cellule so ayeke na yâ ti a-PN so ayeke na kpale ti OXPHOS angbâ na fini. A leke mCherry so ayeke codé AAV-shRNA (ARN ti court épingle) so ayeke mbilimbili na ndo ti mRNA ti PCx ti ngbo (AAV-shPCx), na a zia na yâ ti cerveau ti ngbo ti Mfn2cKO virus ni wala mbeni ye so a iri ni scrambled control (AAV-scr). A sala kusala na injection ni na yâ ti yenga osio ti ngu ti lo (Foto 5A) ti wara mbeni nzoni knockdown ti PCx na ngoi so PCx ayeke fa ye mingi (Foto 3C) na couche ti acellule ti PN angbâ lakue nzoni (Foto 1A). A yeke nzoni ti hinga so ti pika PCx (Foto S8A) ayeke gue na mbeni kota guengo na li ni ti kuâ ti PN, so ayeke gi na yâ ti a-anneau so ayeke na kobela ni (Foto 5, B na C). Ti hinga ye so ayeke si na yâ ti tere ti zo, a yeke nzoni e manda ye na ndo ti dutingo ti redox ti PNs na peko ti so a fâ yâ ti PCx nga na biocapteur optique Grx1-roGFP2 so a sara kua na AAV (Foto S8, B ti si na D) ti bâ wala a yeke na lege ni ti tene a sara kua na ni. Na pekoni, a sala kusala na microscopie ti bango na lege ti fini ti azo use (FLIM) na yâ ti akete kete mbage ti cerveau ti Mfn2cKO so ayeke na yenga 7 wala ti azo so ayeke na yâ ti litter ti bâ wala a lingbi ti gbian yâ ti dutingo ti redox ti cytoplasme na peko ti so a bâ wala a yeke na lege ni (Foto S8, E ti si na G). Azo so abâ ni afa so mbeni kota guengo na li ni ti dutingo ti oxidation ti mbeni PN ti Mfn2cKO oko so ayeke na PCx pëpe, so ayeke nde na a-neurone ti komande wala a-PN ti Mfn2cKO so ayeke fa gi shRNA so a scrambled (Foto 5, D na E). Na ngoi so a yeke sara si PCx abâ gigi, wungo ti a-PN ti Mfn2cKO so afa so ala yeke na mbeni kota oxidation ague na li ni fani ota (Foto 5E), so afa so PCx so ayeke na yâ ti a-neuron so ayeke na yâ ti a-neurone so ayeke na yâ ti ngu abata ngangu ti redox.
(A) Mbeni schéma so afa programme ti tara ti ziango na yâ ti zo AAV so ayeke codé shPCx na ngoi so a sara kua na lege ti métabolisme so a fa ni. (B) A-image ti confocal so afa ambage ti cerveau so ayeke na yenga 8 na yâ ti asusu ti Mfn2cKO so a transduire ni na a zia marque na ndo ni na mbeni ye so ayeke tiri na calcineurine na yâ ti ayenga 4. Barre ti échelle ni, 450μm. (C) Fango wungo ti acellule ti Purkinje na yâ ti a-boucle so a sara ni na AAV (analyse ti variance so ayeke na lege oko; n = 3 ti si na 4 ti asusu). A fa asango ni tongana moyenne±SEM; ***P<0,001. (D) Foto ti FLIM so afa ngu ti fini ti PN so ayeke na yenga 7 so ayeke fa na gigi glutathione redox capteur Grx1-roGFP2 na gbe ti aye so a fa ti tara na ni. LUT (tableau ti bango ndo) ratio: ngoi so zo angbâ na fini (na picoseconde). Barre ti échelle, 25μm. (E) Histogramme ni afa kangbingo yâ ti akota ye ti fini ti Grx1-roGFP2 so alondo na (D) (n=158 ti si na acellule 368 na yâ ti asusu use so ayeke na gbe ti aye oko oko). Tableau ti pièce so ayeke na ndo ti histogramme oko oko: afa wungo ti acellule so ayeke na akota ngele ti fini so ayo mingi (rouge, oxidé) wala so ayeke nduru mingi (bleu, so adë), so ahon 1 SD ti ngele ti fini ti moyenne na yâ ti CTRL-AAV-scr. (F) Modèle so a fa ni afa so upregulation ti PCx ti neuron ayeke bata zo.
Na yâ ti aye kue, asango so e mû ge afa so kiringo ti fa MFN2 alingbi ti zi biani PN so ague na li ni mingi so ayeke na kota kpale ti OXPHOS, kota kpale ti mtDNA, nga na mbeni ye so ayeke tâ nde mingi so ayeke tongana ista, na tongaso a yeke mû lege ti gue na li ni lakue même na yâ ti akobela so ague na li ni. Neurodégénérescence ayeke mû mbeni ye so afa so ye ni asi kozoni si acellule ni akui. A yeke ngangu pëpe ti tene a-neuron asara si a-athérosclérose (mbeni ye so ayeke sara si a-athérosclérose akiri aga nzoni na yâ ti cycle ti TCA), so ayeke kanga lege na PCx ti sigigi na yâ ti a-PN so ayeke na OXPHOS pëpe nga so ayeke sara si a-cellule akui mingi, na tongaso a yeke sara kua ti batango zo (Foto 5F).
Na yâ ti étude so, a mû mbeni ye so afa so kiringo tënë ti PNs na kpale ti OXPHOS ayeke ti tene yeke yeke a-athérosclérose ti cycle ti TCA abungbi oko na lege ti lege ti sarango kua so ayeke sara si aprogramme ti métabolisme asara kua. A fa so gingo nda ti ye ti proteomique ni ayeke tâ tënë na lege ti akode mingi so ayeke mû maboko na zo na a fa so tongana a yeke ngangu na ala ti sara kua nzoni pëpe, a-neurone ayeke na mbeni mara ti élasticité ti métabolisme so zo ahinga ni kozo pëpe. Na bê ti e adö ti bâ so, kusala ti kiringo na a-appareil ni kue ayeke marqué pëpe biani dutingo ti métabolisme so ayeke gue legeoko na neurodégénérescence yeke yeke na lege so zo alingbi ti kiri na ni pëpe, me asango ti e afa so a lingbi ti duti mbeni neuron ti batango tele même na yâ ti ngoi so ayeke kozoni na kuâ ti acellule Mécanisme de compensation fonctionnel. Ye so ala wara afa so a-neurone ayeke na mbeni kota ngangu ti sarango ye na yâ ti tere ti zo. Ye so afa so tongana a kiri a zia MFN2 na yâ ti tere ti zo na pekoni, a lingbi ti sara si akota marqueur ti métabolisme ni akiri na peko nga ti kanga lege na PN ti buba. Nde na so, a yeke kanga lege na kobela ti athérosclérose nga a yeke sara si a-nerf ni ayeke sara kua hio. azo so ayeke sara ye ti pitan.
Mbeni ye so apika bê mingi so e wara na yâ ti gingo nda ti ye ti e ayeke so a-PN so ayeke na OXPHOS pëpe alingbi ti changé yâ ti cycle ti TCA na lege ti ambeni enzyme so ayeke sara si a-arteriosclérose abâ gigi. A yeke wara na yâ ti a-cellule ti cancer mbeni ye so ayeke si ka mingi, na ambeni na popo ti ala aluti na ndo ti glutamine ti mû maboko na a-intermédiaire ti cycle ti TCA ti sara si a-équivalent so ayeke sara si a-équivalent ti réduction adë, so ayeke pusu chaîne ti pupu nga ti bata a-précurseur ti biosynthèse ti lipidi nga na ti nucléotide (39 , 40). Mbeni gingo nda ti ye so asi ade ti ninga pëpe afa so na yâ ti anyama so ayeke na tere ti zo so ayeke na kpale ti OXPHOS, kiringo ti bungbi glutamine/glutamate ayeke nga mbeni kota ye (5, 41), ndo so lege so glutamine ayeke lï na yâ ti cycle ti TCA aluti na ndo ti Ndali ti ngangu ti OXPHOS (41). ). Ye oko, a yeke wara pëpe mbeni ye so afa polele so mbeni ye so ayeke legeoko na popo ti plasticité métabolique ti a-neurone na yâ ti tere ti zo nga na lege so lo lingbi ti sara kua na ni na yâ ti aye so andu kobela. Na yâ ti mbeni étude so a sara ade ti ninga pëpe, a fa so akozo neuron ti cortique ayeke bungbi abungbi ti glutamate ti tene a sara kua na ni, na tongaso a yeke sara si a-oxydant nga na a-athérosclérose ayeke sara kua nzoni ( 42 ). A yeke nzoni ti hinga so na gbe ti kangango lege ti yorö ti enzyme ti cycle ti TCA so ayeke succinate déhydrogénase, a mä ​​na bê so carboxylation ti pyruvate ayeke bata bungbingo ti oxaloacétate na yâ ti a-neuron ti granule ti cerveau so a dü ni ( 34 ). Me, a yeke nzoni ti tene e sara kua na a-athérosclérose mingi na yâ ti a-astrocyte (43). Na yâ ti aye so, asango ti e afa so aPN so abuba ndali ti OXPHOS na yâ ti tere ti zo alingbi ti changé ti ga BCAA so ayeke buba nga na carboxylation ti pyruvate, so ayeke akota ye use so ayeke sara si a yeke wara a-intermédiaire ti piscine ti TCA. Atâa so a tene so BCAA ayeke mû maboko na catabolisme ti neuron ti sara si ngangu ti zo abâ gigi, na ndo ti kua so glutamate na GABA ayeke sara ti tene a-neurone asara kua nzoni (44), a ngbâ ti wara mbeni ye ti fa so aye so ayeke si na yâ ti terê ti zo pëpe. Tongaso, a yeke ngangu pëpe ti tene so a-PN so ayeke sala kusala nzoni pëpe alingbi ti sala si a-intermédiaire ti TCA so a pusu ni na lege ti salango ye ti assimilation ague na li ni na lege ti salango si a-athérosclérose akiri aga mingi. Na yâ ti ambeni ye, a lingbi ti hunda ti tene a sara kua na PCx ti bata mbeni kota hundango ye ti acide aspartique, so a fa ni na yâ ti acellule so ayeke kono so ayeke na kpale ti mitochondrie ( 45 ). Me, gingo nda ti ye ti e ti métabolisme afa pëpe so mbeni kota gbiango ye asi na yâ ti nivo ti acide aspartique so ayeke na yâ ti Mfn2cKO PNs (Foto S6A), so a pensé so a fa na gigi mara ti salango kusala nde nde ti acide aspartique na popo ti acellule so ayeke kono nga na a-neurone so ayeke na peko ti mitose . Atâa so a ngbâ ti hinga mbilimbili lege so PCx ayeke sara kua na ni na yâ ti a-neuron so ayeke sara kua nzoni pëpe na yâ ti tere ti zo, a fa so kiringo tënë so ayeke sara kota kua na yâ ti batango dutingo ti redox ti a-neuron, so a fa ni na yâ ti a-expérience so FLIM asara na ndo ti akete kete cerveau. Mingi ni, ti kanga lege na aPN ti sara si PCx akiri aga nzoni alingbi ti sara si a yeke wara mbeni ye so ayeke sara si acellule ni akui hio. A yeke sara si BCAA abuba nga na carboxylation ti pyruvate ayeke pëpe alege ti sara si anyama so ayeke na tere ti mitochondrie asara kua nzoni pëpe (7). Tongaso, a yeke mo bâ mo tene ala yeke mbeni ye so ayeke kota mingi na yâ ti a-neuron so ayeke na OXPHOS pëpe, même tongana a yeke pëpe gi oko ye so, so ayeke kota ye ndali ti neurodégénérescence. .
Kobela ti cerveau ayeke mbeni mara ti kobela so ayeke sara si li ti zo abuba, so mingi ni a yeke fa ni tongana ataxie nga fani mingi a yeke buba a-PN (46). Azo so ayeke na yâ ti a-neuron so ayeke mbilimbili na yâ ti kpale ti mitocondrie ndali ti so dégénérescence selective ti ala na yâ ti asusu alingbi ti sara si mingi ti a-symptôme ti moteur so ayeke na yâ ti ataxie spinocérébelle ti zo abâ gigi ( 16, 47, 48 ). Na lege ti ambeni tondo, mbeni model ti nyama so a sara ni na transgénique so ayeke na mbeni gene so achangé ayeke na kamba na ataxie ti spinocérebelle ti zo nga ayeke na kpale ti mitochondrie (49, 50), na ye so afa so a yeke kota ye ti manda ye na ndo ti aye so ayeke si tongana zo awara kpale ti OXPHOS na yâ ti PNPH. Tongaso, a yeke mbilimbili nzoni ti zi na popo ti ala nzoni na ti manda ye na ndo ti wungo ti a-neurone so ayeke nde so. Ye oko, teti so a-PN ayeke sala ngangu na ndo azo mingi na a yeke mû mbeni kete mbage ti wungo ti acellule ti cerveau kue, teti gbâ ti a-étude so aluti na ndo ti omics, kangbingo popo ti ala na lege ti sorongo ye tongana acellule kue angbâ lakue mbeni ye so ayeke ngangu. Atâa so a yeke ngangu ti wara absolue manque ti contamination ti ambeni mara ti acellule (mbilimbili a-tissue ti akota zo), a bungbi mbeni nzoni kapa ti dissociation na FACS ti wara wungo ti a-neuron so alingbi ti sara kua na ni ti sara na analyse ti proteomique so ayeke na gbe ni, nga ti wara a-protéine so ayeke na yâ ti a-protéine so ayeke na ndö ti 3000 ti cerebel so a haka ni na 30000. (51). Na batango fini ti acellule kue, kode so e mû ge amû lege na e pëpe gi ti bâ achangement so ayeke si na yâ ti alege ti sarango ye ti terê ti zo na yâ ti a-mitocondrie, me nga ti bâ achangement so ayeke si na yâ ti amba ti lo so ayeke na yâ ti cytoplasme, so ayeke mû maboko na e ti sara kua na a-étiquette ti membrane ti mitochondrie ti sara si mara ti acellule ni aga mosoro mingi. (52, na 53). Kode so e fa so andu gi pëpe mandango ye na ndo ti acellule ti Purkinje, me a lingbi ti sala kusala na ni hio na ndo mara ti acellule kue ti leke achangement so ayeke si na yâ ti cerveau so ayeke na kobela, so na popo ni a yeke wara ambeni tapande ti salango kusala nzoni pëpe ti mitochondrie.
Na pekoni, a wara mbeni fenêtre ti kaïngo kobela na ngoi ti lekengo ye so alingbi ti gbian biani akota fä ti kpale ti cellule na ti kanga lege na bubango ti a-neurone. Tongaso, ti hinga ye so ayeke si na peko ti so a kiri a leke yâ ti akamba so a fa tënë ni ge alingbi ti mû lege na e ti hinga akota ye na ndo ti akode ti kaïngo kobela so alingbi ti sara si a-neurone angbâ na fini na ngoi so a-mitochondrie ayeke sara kua nzoni pëpe. A hunda ti sala ambeni gingo nda ti ye na yâ ngoi so ayeke ga so aye ti hinga achangement so ayeke si na yâ ti ambeni mara ti acellule ti cerveau ti fa biani so kpengba-ndia so alingbi ti sala kusala na ambeni kobela ti li.
A yeke wara na yâ ti MitoPark ni ambeni ye so a iri ni MitoPark (31). Azo ti C57BL/6N so ayeke na loxP so ayeke na terê ti agene ti Mfn2 so a sara tënë ti ala kozo awe (18) na a sara si ala wara anyama ti L7-Cre (23). Na pekoni, a bungbi amolenge so ayeke hétérozygote use so aga na pekoni na asusu so ayeke homozygote Mfn2loxP/Mfn2loxP ti wara na a-knockout ti gene so ayeke nde na ti Purkinje teti Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Na yâ ti mbeni kete wungo ti azo so ayeke sara mariage, a zia na yâ ti allele ti Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) na lege ti ambeni ye nde so abungbi (20). A sala kusala na anyama kue alingbi na awango ti Europe, ti kodoro nga na ti akota ndokua na a mû lege na LandesamtfürNatur ti Umwelt na Verbraucherschutz, Rhénanie du Nord-Westphalie, Zamani. Kusala ti anyama ayeke mû nga peko ti fango lege ti Fédération européenne des Associations des sciences animales de laboratoire.
Na peko ti so a zia anesthésie na yâ ti cervix ti wali so ayeke na ngo, a zi yâ ti ngbo ni (E13). A fâ yâ ti cortex ni na yâ ti mbeni solution ti ingo ti Hanks (HBSS) so a zia na yâ ni Hepes 10 mM na a mû ni na zo na yâ ti mbeni ngu ti Dulbecco so a sara ni na papaïne (20 U/ml) nga na cystéine (1μg/ml). A yeke zia na yâ ti DMEM) na a yeke kangbi yâ ni na lege ti digestion enzymatique. Ml) na 37°C teti penze-ngbonga 20, na pekoni a sala si a zia na yâ ti DMEM so a zia na yâ ni 10% ti sérum ti ngombe so ayeke na yâ ti mama ti lo. A lu a-cellule na ndo ti a-couverture ti verre so a sara ni na polylysine na mbeni densité ti 2×106 na yâ ti mbeni bozo ti culture so ayo 6 cm wala na mbeni densité ti 0,5×105 cellule/cm2 ti tene a bâ ni na lege ti image. Na peko ti angbonga 4, a mû na lo mbeni yorö so ayeke na sérum pëpe ti Neurobasal so ayeke na 1% ti B27 nga na 0,5 mM ti GlutaMax. Na pekoni, a bata a-neuron ni na 37°C nga na 5% ti CO2 na yâ ti ngoi kue so a sara na experiment ni, na a mû na ala kobe fani oko na yâ ti yenga oko. Ti tene a kiri a bungbi ni na yâ ti a-in vitro, a mû 3μl (plaque ti culture so ayeke na adû 24) wala 0,5μl (plaque ti culture so ayeke na a-adû 24) ti vecteur ti virus AAV9 so ayeke na gbe ni ge ti sava na a-neuron na use lango ni na yâ ti a-in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, numéro ti catalogue 105530-AAV9) nga na AAV9.
A yeke wara na yâ ti plasmide ti Addgene #23212 na #23213 (GKPIPNPLLGLDST) molongo ti V5 (GKPIPNPLLGLDST) so ayeke na yanga ti C, na a bungbi ni na mCherry na yâ ti cadre na lege ti molongo ti T2A. Grx1-roGFP2 ayeke mbeni matabisi so alondo na TP Dick DFKZ (Centre ti gingo nda ti ye ti Allemagne). Na ziango na place ti kasete ti tdTomato na lege ti akode ti clonage so azo ayeke sala ka, a sala si kasete ni aga kete na yâ ti ngbongboro ti pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (numéro ti référence ti Addgene 28306) ti sigigi na pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFNGAV-V5, . Azo so ayeke na yâ ti groupe ti FLEX-mCerise-T2A-MFN1-V5 nga na pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. A sara kua na mara ti kode tongaso ti sara si a leke mbeni vecteur ti komande so ayeke pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Ti tene a leke AAV-shPCx, a hunda ti wara mbeni vecteur ti plasmide AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), so na yâ ni a yeke wara molongo ti ADN so ayeke codé shRNA so ayeke sara kua na PCx ti nyama ti ngonda (5′GTAGCTAGGTGTGTGACTAACTA 3′) Na gbe ti komandema ti U6, mCherry ayeke sala kusala na gbe ti komandema ti CMV. A leke a-auxiliaire ti AAV alingbi na awango ti azo so asara ni (Cell Biolabs). Na nduru tënë, lo sara kua na mbeni plasmide so ayeke mû lege na lo ti mû mbeni plasmide so ayeke mû lege na lo ti sara kua na cellule ti 2900. (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) wala Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) so ayeke na yâ ti gene ti codé ni, nga na protéine ti capside ti AAV1 so ayeke na yâ ti protéine ti capside nga na protéine ti mungo maboko na zo. A wara bruit ti virus ni na lege ti a-cycle ti congélation-dégel na yâ ti mbeni bain ti glace/éthanol so ahule na a lysé acellule na yâ ti saline tamponnée par phosphate (PBS). A sukula vecteur ti AAV na lege ti mbeni ultracentrifuge so ayeke na gradient ti iodixanol so ayeke ngbâ lakue pëpe (ngbonga 24 na 32 000 rpm na 4°C) na a bungbi ni na lege ti mbeni filtre ti Amicon so ayeke na ultra-15. Titre ti génome ti AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 copie ti génome (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry so a mû ni na lege ti wungo ti aye (PCRd5) ayeke tongana ti so a fa ni kozo awe. (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) na AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
A zi akozo neuron na yâ ti PBS 1x so ayeke glacé, a sara si a sara si a ga homogénéisé na yâ ti tampon ti lyse ti Triton X-100 / 0,5% ti désoxycholate ti sodium/PBS so ayeke na phosphatase nga na mbeni ye so ayeke kanga lege na protéase (Roche). A sara kua na mbeni ye so a iri ni acide bicinchonique ( Thermo Fisher Scientific ) ti hinga wungo ti aprotéine. Na pekoni, a kangbi yâ ti aprotéine ni na lege ti électrophorèse na lege ti gel ti SDS-polyacrylamide, na pekoni a zia ni na ndo ti mbeni membrane so a sara ni na fluorure ti polyvinylidène (GE Healthcare). Bloqué asite so ayeke mbilimbili pëpe na a zia na yâ ti a-anticorps ti kozoni (bâ Tableau S1 ti hinga anzene nzene ye na ndo ni) na yâ ti warango 5% na yâ ti TBST (saline tamponée à Tris avec Tween), a-étape ti sukulango ngu nga na a-anticorps ti use ni na yâ ti TBST Incubate. A yeke sara si a yeke wara akozo anticorps na yâ ti bï ni na +4°C. Na peko ti so a sukula ni awe, a zia use anticorps ni na ndo ti lo teti angbonga 2 na ndo so dê ayeke dä. Na pekoni, na ziango na yâ ti oko blot ni mbeni ye so ayeke tiri na β-actine, a fa so oko charge ni ayeke dä. A yeke wara ni na lege ti gbiango yâ ti aye so ayeke sara si zo abâ gigi nzoni (GE Healthcare).
A zia na yâ ti a-neuron so a zia ni kozo awe na ndo ti ambeni ye so a kanga ni na verre, na a zia ni na 4% ti paraformaldehyde (PFA)/PBS na ngoi so a fa ni na yâ ti chambre teti penze-ngbonga 10. A yeke zia kozoni na yâ ti abongo ti couvercle ni 0,1% ti Triton X-100/PBS teti penze-ngbonga 5 na ndo so dê ayeke dä, na pekoni a yeke zia na yâ ni mbeni tampon ti kangango lege na ni [3% ti albumine ti mênë ti ngombe (BSA)/PBS]. Na use lango ni, a sukula a-couverture ni na mbeni tampon ti kangango lege na a zia na yâ ni mbeni ye so alingbi na ni so a iri ni fluorophore-conjugué secondaire anticorps teti angbonga 2 na ndo so dê ayeke dä; na pekoni, a sukula a-échantillon ni nzoni na yâ ti PBS na a sara si a zia 4′,6-diamidino-2 -Phénilindole (DAPI) na ndo ti diapositive ti microscope ni na Aqua-Poly/Mount.
A mû na asusu (akoli na awali) anesthésie na lege ti mbeni yorö so a iri ni kétamine (130 mg/kg) nga na xylazine (10 mg/kg) na yâ ti poro ti tere ti ala na a mû na ala mbeni yorö so ayeke sara si zo abâ pasi pëpe (5 mg/kg) , Na a zia ala na yâ ti mbeni ye ti sarango na kua (Kopd a pamf). Zia crâne ni na gigi na sala kusala na mbeni foret ti dent ti sala si mbage ti cerveau so alingbi na bio ti mis aga kete (alondo na lambda: queue 1,8, latéral 1, so alingbi na lobule IV na V). Lo mû mbeni aiguille ti seringue so akono ti leke na mbeni kete dû na yâ ti crâne ni ti tene lo buba pëpe akamba ti mênë so ayeke na gbe ni. Na pekoni, a yeke zia kete kete capillaire ti verre so a fa ni na yâ ti kete dû ni (alondo na -1,3 ti si na -1 na mbage ti yâ ti dura mater ni), na a yeke zia 200 ti si na 300 nl ti AAV na yâ ti kete injecteur ni (Narishige) na lege ti a-seringue ti maboko (Narishige tisure) na ngoi ti pression ti sever2. fenêtre ti penze-ngbonga. Na peko ti so a mû na lo yorö ni awe, zia capillaire ni na yâ ti ambeni penze-ngbonga 10 ti tene virus ni amû ndo kue. Na peko ti so a zi a-capillaire ni awe, a yeke su poro ti tere ni nzoni ti tene place ti kä ni ason mingi pëpe nga ti tene nyama ni awara ngangu. A mû na anyama ni yorö ti kaïngo kobela (caspofen) teti lango mingi na peko ti so a opéré ala, na ngoi ni so a bâ nzoni dutingo ti tele ti ala na pekoni a fâ ala na ngoi so a fa. A sala kusala na akode kue alingbi na awango ti Europe, ti kodoro nga na ti akota ndokua na a mû lege na LandesamtfürNatur ti Umwelt na Verbraucherschutz, Rhénanie du Nord-Westphalie, Zamani.
A mû na anyama ni mbeni yorö so a iri ni kétamine (100 mg/kg) nga na xylazine (10 mg/kg), na a zia na yâ ti bê ti ala kozoni PBS 0,1 M, na pekoni a zia PFA 4% na yâ ti PBS. A fâ yâ ti nyama ni na a zia ni na yâ ti 4% ti PFA/PBS na yâ ti bï oko na 4°C. A sala kusala na mbeni ye so ayeke yengi (Leica Microsystems GmbH, Vienne, Autriche) ti leke na ambage ti sagittal (so akono 50 μm) so alondo na yâ ti cerveau so a leke ni nzoni na yâ ti PBS. Tongana a fa mbeni ye nde pëpe, a sala kusala na couleur ti ambage so ayeke huru na liberté tongana ti so a fa na nduzu ge (13) na ndo ti ndowa ti chambre na a sala si a ngbâ ti huru. Na nduru tënë, kozoni, a zia na yâ ti akete kete ye so a wara ni 0,5% ti Triton X-100/PBS teti penze-ngbonga 15 na ndo so dê ayeke dä; ti ambeni épitope (Pcx na Shmt2), na lege ti na yâ ti tampon ti tris-EDTA na 80°C (PH 9) ti zia wâ na yâ ti akete kete ye ni teti penze-ngbonga 25 ahon ti sara tongaso. Na pekoni, a zia ambage ni na yâ ti mbeni tampon ti kangango lege (3% BSA/PBS) na 4°C na bï oko na ziango ni na yâ ti mbeni ye so a iri ni primaire anticorps (bâ Tableau S1). Na ndade ni, a sukula ambage ni na mbeni tampon ti kangango lege na a zia na yâ ni mbeni ye so alingbi na ni so abungbi na fluorophore teti angbonga 2 na ndo so dê ayeke dä; na pekoni, a sukula ambage ni nzoni na yâ ti PBS, a zia DAPI na ndo ni, na pekoni a kanga ni na AquaPolymount Na ndo ti mbeni diapositive ti microscope.
A sala kusala na mbeni microscope so ayeke sala kusala na laser (TCS SP8-X wala Feuille de lumière numérique TCS, Leica Microsystems) so ayeke na mbeni vuru lumière nga na mbeni laser so ayeke na a-diode 405 ti mû na image ti échantillon ni. Na lege ti salango kusala na fluorophore na bungbingo signal ni na lege ti Hybrid Detector (HyDs), a sala kusala na logiciel LAS-X ti bungbi a-image so abungbi na ndo oko so alingbi na échantillonnage ti Nyquist na lege ti molongo: teti a-panneau so ayeke ti wungo pëpe, a yeke sala kusala na a-image so ayeke na ngangu mingi (na tapande, na yâ ti a-cellule somatique nga na a-dendrite ti PDN) mt . Mode ti lumièreR). A yeke sara kua na gating so alondo na 0,3 ti si na 6 ns ti sara si a ngbâ kete.
Image ti tâ ngoi ti acellule so a soro ni. Na peko ti so a soro ni na yâ ti mbeni ye so a iri ni Neurobasal-A so ayeke na 1% ti B27 nga na 0,5 mM ti GlutaMax, a zia acellule ni hio na ndo ti a-écran ti verre so a sara ni na poly-l-lysine (μ-Décran8 Bon, Ibidi, numéro ti catalogue 80826) , Na pekoni a bata ni na mbeni ndo ti 1% ti CO2 ti si na 3000. ti leke. A sala kusala na a-image na ngoi ti tâ ye na ndo mbeni microscope ti Leica SP8 so ayeke sala kusala na laser so ayeke na mbeni vuru laser, HyD, 63×[1,4 ouverture numérique (NA)] ti bango na ye na mafuta nga na mbeni ndo ti chauffage.
A zia na yâ ti ngbo ni hio anesthésie na dioxyde de carbone na a fâ li ti lo, a zi cerveau ni hio na yâ ti crâne ni, na a fâ yâ ni na yâ ti mbeni mbage ti sagittal so akono 200μm (ti sara na experiment ti ziango marque na ndo ti 13C) wala 275μm (ti sara na experiment ti photon use) so asi singo na aye so ayeke na gbe ni ge The VHr50. Scientific, Walldorf, Allemagne) asi singo na aye so: 125 mM ti glace, so asi singo na carbone (95% ti O2 na 5% ti CO2) so ayeke na Ca2 mingi pëpe + ngu so a leke ni na maboko ti zo (ACSF) NaCl, KCl 2,5 mM, tampon ti Na3O m2 1,25 mM, pho52 ti sodium 1,25 mM. glucose, CaCl2 0,5 mM nga na MgCl2 3,5 mM (pression ti ngu so ayeke na yâ ti ngu ni ayeke 310 ti si na 330 mmol). A yeke wara na yâ ti cerveau ni mbeni chambre so ayeke na Ca2 + ACSF mingi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, tampon ti phosphate ti sodium 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, Ca2.glucose 25,0 mM nga na Ca2.0M 100 mM. MgCl2) Moyen) pH 7,4 na 310 ti si na 320 mmol).
Na ngoi ti salango kusala na a-image ni, a gue na akete kete ye ni na yâ ti mbeni ndo so a leke ni nde teti a-image ni, na a sala kusala na ni na gbe ti mbeni ACSF so ayeke mû lakue na zo na mbeni ndo so dê ayeke dä lakue na popo ti 32° ti si na 33°C. A sala kusala na mbeni microscope ti bango na lege ti laser so ayeke na a-photon mingi (TCS SP8 MP-OPO, Microsystems ti Leica) so a leke ni na mbeni ye ti bango na ye ti Leica 25x (NA 0,95, ngu), laser ti Ti: Saphir (Caméléon Vision II, Cohérent) ti sala na a-image ti akete kete ye. Module ti FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM ti Grx1-roGFP2. A yeke na lege ti FLIM so ayeke na a-photon use na yâ ti akete kete cerveau so ayeke na sagittal, ndo so biocapteur Grx1-roGFP2 ayeke sara kua na a-PN. Na yâ ti couche ti PN, a soro ndo ti warango ye ni ndulu na 50 ti si na 80 μm na gbe ti ngbongboro ti ngbongboro ni ti tene a wara mbeni PN so ayeke na fini (so ti tene, a yeke wara pëpe mbeni structure ti perle wala achangement ti morphologie ti a-neurone so ayeke na tere ti a-dendrite) nga na a-appareil ti roGFP2 so ayeke sara kua nzoni nga na AAVx so ayeke codé sh mCerise). Abungbi a-image so ayeke na yâ ti mbeni pile oko na zoom numérique 2x [longueur d’onde d’excitation: 890 nm; 512 nm na 512 ti pixel]. A yeke wara na yâ ti mbeti ni: HyD ti yâ ni, groupe ti filtre ti fluorescéine isothiocyanate (FITC)] nga na mbeni moyenne ti image na yâ ti penze-ngbonga 2 ti si na 3 ti tene a bungbi a-photon so alingbi (a-photon 1000 na ndo ni kue) ti tene a lingbi na courbe ni. A yeke na lege ni ti tene a sara kua na Grx1-roGFP2 ti bâ wala a yeke na lege ni ti tene a sara kua na ni na ngoi so a zia H2O2 10 mM so ayeke exogène na yâ ti perfusion ti ACSF (ti sara si a sara si oxidation ni akiri aga kota, na a sara si a sara si fini ti zo akiri aga mingi), na pekoni a zia na yâ ni mrethizitoM ti fini ti lo). ti sara si ngu ti fini ti zo adë) (Foto S8, D ti si na G). Lo sara kua na logiciel FLIMfit 5.1.1 ti bâ yâ ti aye so lo wara, lo lingbi na courbe ti dégradation exponentielle oko ti image ni kue na IRF so a mû mesure ni (fonction de réponse d’instrument), na χ2 ayeke ndulu na 1. Ti diko ngoi ti fini ti mbeni PN oko, masque ni ayeke na maboko ti each life na yâ ti nerf ni . a yeke sala kusala na ni ti diko wungo ti aye.
Mitochondrie ayeke sara kua nzoni. Na peko ti so a zia na yâ ti mbage ti acute ni 100 nM TMRM so a zia ni droit na yâ ti ACSF so a perfusé ni teti penze-ngbonga 30, a mû mbeni microscope so ayeke na a-photon use ti bâ achangement so ayeke na yâ ti mitocondrie ti PNs. A sala kusala na a-image ti TMRM na lege so a zia wâ na yâ sonde ni na 920 nm na a sala kusala na HyD so ayeke na yâ ni (isothiocyanate ti tétraméthylrhodamine: 585/40 nm) ti bungbi a-image; na lege ti salango kusala na oko ngbongboro ngbongboro ngbongboro ngbongboro tënë ni me na salango kusala na mbeni HyD ti yâ ni nde (FITC :525/50) ti sala na image ti mtYFP. Lo sara kua na plug-in ti ImageJ so ayeke sara kua na Calculateur ti image ti bâ ngangu ti mitocondrie so ayeke na yâ ti acellule oko oko. Na nduru tënë, a yeke sara kua na équation ti plug-in: signal = min (mtYFP, TMRM) ti hinga na ndo ti mitocondrie so afa signal ti TMRM na yanga ti Purkinje Somali na yâ ti image ti confocal ti mbeni pile oko ti chaîne so alingbi na ni. Na pekoni, a yeke diko wungo ti pixel so ayeke na yâ ti masque so aga na pekoni, na a yeke normalisé ni na ndo ti image ti threshold so alingbi na ni so ayeke na yâ ti canal ti mtYFP ti wara mbage ti mitochondrie so afa ngangu ti mitochondrie ni.
A zi yâ ti image ni na lege ti mbeni logiciel so iri ni ayeke Huygens Pro (Imagerie de volume scientifique). Ti afoto ti acarreaux so a scanner ni, a yeke sara montage ti mbeni carreaux oko na lege ti algorithme ti couture automatique so logiciel LAS-X amû. Na peko ti so a sara calibration ti image ni awe, sara kua na ImageJ nga na Adobe Photoshop ti sara kua na image ni nzoni nga ti leke lumière nga na kangbi so ayeke na popo ti image ni legeoko. Lo sara kua na Adobe ti leke na adessin.
mtDNA ayeke sara kua na ni. A diko wungo ti akete kete ye so ayeke na yâ ti mtDNA na ndo ti ambage ti cerveau so a sû na ndo ni ambeni ye so ayeke tiri na ADN na lege ti microscope confocal. A leke ando oko oko so a leke ni ndali ti tere ti cellule ni nga na nucléus ti cellule oko oko, na a sara kua na plug-in Multi Measure (logiciel ImageJ) ti diko ndo ni oko oko. Zia ndo ti nucléaire ni na ndo ti tere ti cellule ni ti wara ndo ti cytoplasme ni. Na pekoni, a sala kusala na plug-in Analyze Particles (logiciel ImageJ) ti diko na lege ti automatique a-ADN ti cytoplasme so afa mtDNA na ndo image ti threshold, na a sala si a-résultat so a wara aga normale na moyenne ti PN ti asusu ti CTRL. A yeke fa ye so asi tongana wungo ti nucléoside so ayeke na yâ ti acellule oko oko.
A yeke sara kua na protéine. Lo sara kua na plug-in ti ImageJ so ayeke sara kua na Calculateur ti image ti bâ wala a yeke sara kua na aprotéine na yâ ti PN na niveau ti cellule oko oko. Na nduru tënë, na yâ ti image ti confocal so ayeke na couche oko ti chaîne so alingbi na ni, na lege ti équation so: signal = min (mtYFP, anticorps), a yeke hinga ndo ti mitochondrie so afa so zo ni ayeke sara kua nzoni na mbeni ye so ayeke na yâ ti Purkina. Na pekoni, a yeke diko wungo ti pixel so ayeke na yâ ti masque so aga na pekoni, na pekoni a yeke normalisé ni na ndo ti image ti threshold so alingbi na ni so ayeke na yâ ti canal ti mtYFP ti wara mbage ti mitochondrie ti protéine so a fa ni.
Purkinje ayeke sara kua na a-cellule. A sala kusala na plug-in ti Cell Counter ti ImageJ ti bâ wungo ti acellule ti Purkinje na lege so a kangbi yâ ti wungo ti acellule ti Purkinje so a diko ni na yongo ti bague ti cerveau so a diko ni.
Lekengo ambeni tapande nga na bungbingo ni. A leke cerveau ti groupe ti bango ndo nga na ti asusu ti Mfn2cKO na yâ ti 2% ti PFA/2,5% ti glutaraldehyde na yâ ti tampon ti phosphate 0,1 M (PB), na pekoni a leke ambage ti coronal na lege ti ciliate (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienne, Autriche) (Epaisseur ti tampon ni ayeke 50 ti si na PBn 60). tétraoxyde na ferrocyanure ti potassium 1,5% na yâ ti chambre teti ngbonga 1. A sukula ambage ni fani ota na ngu so a distillé ni, na pekoni a zia na yâ ni éthanol 70% so ayeke na acétate ti uranyl 1% teti penze-ngbonga 20. Na pekoni, a zi ngu na yâ ti ambage ni na yâ ti alcool so a leke ni nzoni na a zia ni na yâ ti résine époxy ti Durcupan ACM (résine ti futingo ti Araldite M) (Sciences de la microscopie électronique, numéro ti catalogue 14040) na popo ti akete diapositive ti verre so a sara ni na silicium, na nda ni na 60°C a sara si a ga polymérisation na yâ ti four48. A soro ndo ti cerveau ti zo ni na a fâ ambeni mbage ni so ayeke tâ kete mingi na ndo ti Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienne, Autriche) na a pika ni na ndo ti mbeni grille ti cuivre so ayo 2×1 mm so a sara ni na mbeni film ti polystyrène. A zia ambage ni na mbeni solution ti 4% ti uranyl acetate na yâ ti H2O teti penze-ngbonga 10, a sukula ni na H2O fani mingi, na pekoni a sukula ni na citrate ti plomb ti Reynolds na yâ ti H2O teti penze-ngbonga 10, na pekoni a sukula ni na H2O fani mingi. A mû akete kete ye na lege ti mbeni microscope ti électronique so ayeke sara kua na mbeni caméra numérique so a iri ni TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, États-Unis). Zamani).
Ti asusu so ayeke na kobela ti AAV, a kangbi yâ ti cerveau ni na a fâ yâ ni na yâ ti mbeni mbage ti sagittal so akono 1 mm, na a bâ cerveau ni na lege ti mbeni microscope so ayeke na fluorescence ti hinga na ndo ti bague so ayeke na kobela ti AAV (so ti tene, mCherry so ayeke fa tënë). A yeke gi a-expérience so na yâ ni ziango AAV na yâ ti zo asara si couche ti acellule ti Purkinje (so ti tene ndulu na couche ni kue) ayeke sara kua nzoni mingi na yâ ti a-anneau ti cerveau use so aga na peko ti mba. A sara si a zia na yâ ti boucle so a sara ni na AAV ti tene a zia ni na yâ ti mbeni bï (4% ti PFA nga na 2,5% ti glutaraldehyde na yâ ti tampon ti cacao 0,1 M) na a kiri a sara kua na ni. Ti zia na yâ ti EPON, a sukula anyama so a leke ni nzoni na tampon ti cacao ti sodium 0,1 M (Applichem), na a zia ni na yâ ti tampon ti cacao ti sodium 0,1 M (Applichem) 0,1 M, na pekoni a sukula ni teti angbonga 2. A yeke fani 3 la a yeke mû tampon ti cocamide 0,1 M. Na pekoni, a mû molongo ti éthanol so ayeke gue na li ni ti zia na yâ ti éthanol oko oko na 4°C teti penze-ngbonga 15 ti tene ngu ahon na yâ ti poro ni. A zia nyama ni na yâ ti oxyde ti propylène na a zia ni na yâ ti EPON (Sigma-Aldrich) na bï oko na 4°C. Zia bongo ni na yâ ti fini EPON na ndo so dê ayeke dä teti angbonga 2, na pekoni zia ni na ndo ti 62°C teti angbonga 72. Lo mû mbeni ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) nga na mbeni épée ti diamant (Diatome, Biel, Suisse) ti fâ yâ ti ambage so ayeke tâ kete mingi so ayo 70 nm, na ti zia na yâ ni 1,5% ti acétate ti uranyl teti penze-ngbonga 15 na 37°C, na ti zia na yâ ni mbeni solution ti citrate ti plomb penze-ngbonga 4. A mû a-électronique ni na lege ti mbeni microscope ti électronique so ayeke na JEM-2100 Plus (JEOL) so ayeke na mbeni logiciel ti Caméra OneView 4K 16-bit (Gatan) nga na mbeni logiciel ti DigitalMicrograph (Gatan). Ti gi nda ti ye, a mû a-électronique so ayeke na zoom numérique 5000× wala 10 000×.
A yeke wara na yâ ti a-mitocondrie ni. Ti a-analyse kue, a fa na maboko acontour ti amitocondrie oko oko na yâ ti a-image numérique na lege ti logiciel ImageJ. A yeke sara kua na aparamètre ti morphologie nde nde. A yeke fa wungo ti amitochondrie tongana mbeni wungo so a wara na lege ti kangbingo yâ ti wungo ti amitochondrie kue ti acellule oko oko na ndo ti cytoplasme (ndo ti cytoplasme = ndo ti cellule-ndo ti nucléus ti cellule) × 100. A yeke diko wungo ti ronde ti mitochondrie na lege ti formule [4π∙2(zo)]./périmètre. A gi nda ti mara ti ista ti amitocondrie na a kangbi yâ ni na ambage use (“tubulaire” na “blister”) alingbi na akota forme ti ala.
A yeke wara na yâ ti autophagosome/lysosome wungo ti densité ni. Lo sara kua na logiciel ImageJ ti fa na maboko ti lo acontour ti autophagosome/lysosome oko oko so ayeke na yâ ti image ti numérique ni. A yeke fa ndo ti autophagosome/lysosome tongana mbeni wungo so a diko ni na lege so a kangbi yâ ti ndo ti autophagosome/lysosome kue ti yâ ti acellule oko oko na ndo ti cytoplasme (ndo ti cytoplasme=ndo ti cellule-nucléus)×100. A yeke wara wungo ti a-autophagosome/lysosome na lege so a kangbi yâ ti wungo ni kue na wungo ti a-autophagosome/lysosome so ayeke na yâ ti acellule oko oko (na lege ti ndo ti cytoplasme) (ndo ti cytoplasme = ndo ti cellule-ndo ti nucléaire).
Etiquetage ti sectionnement ti acute na ti lekengo a-échantillon. Ti a-expérience so ahunda ti tene a zia marque na ndo ti glucose, a yeke mû akete kete cerveau so ayeke na yâ ti mbeni chambre so a sara ni kozo ti tene a zia na yâ ti ni, so na yâ ni a yeke wara carbone saturé (95% O2 na 5% CO2), Ca2 + ACSF so ayeke kota mingi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, phosphate ti sodium m3M 1,25 mM. 25,0 mM ti d-glucose, 1,0 mM ti CaCl 2 na 2,0 mM ti MgCl 2, so a leke ni na pH 7,4 na 310 ti si na 320 mOsm), so na yâ ni glucose ayeke 13 C 6- Glucose so ayeke na place ti glucose (Eurisotop, numéro ti catalogue63-1). Ti sara a-expérience so ahunda ti tene a zia marque na ndo ti pyruvate, a yeke mû akete kete cerveau so ayeke na yâ ti a-acSF so ayeke na Ca2 + ACSF (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, tampon ti phosphate ti sodium 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, Ad2M m0 d-glucose 25,0 mM, Ca02M d-glucose 25,0 mM). MgCl2, a leke ni na pH 7,4 na 310 ti si na 320mOsm), na a zia na yâ ni 1-[1-13C]pyruvate 1mM (Eurisotop, numéro ti mbeti CLM-1082). Zia ambage ni na yâ ti penze-ngbonga 90 na 37°C. Na peko ti so a sara kua na ni, a sukula ambage ni hio na mbeni ye so ayeke na yâ ti ngu (pH 7,4) so ​​carbonate d’ammonium 75 mM ayeke na yâ ni, na pekoni a sara si a ga oko na yâ ti 40:40:20 (v:v:v) acétonitrile (ACN): méthanol: ngu. Na peko ti so a zia ambage ni na ndo ti glace teti penze-ngbonga 30, a zia a-échantillon ni na ndo ti 21 000 g teti penze-ngbonga 10 na 4°C, na a zia ngu so ayeke polele na ndo ni na yâ ti mbeni masini ti SpeedVac. A bata a-pellet ti métabolite so ahule awe na -80°C juska a sara analyse ni.
A yeke sara kua na chromatographie ti ngu-spectrométrie ti masse ti bâ na a-acide aminé 13 so a zia marque ti C na ndo ni. Ti sara kua na chromatographie ti masse ti ngu (LC-MS), a kiri a zia na yâ ti 75μl ti ngu so ayeke na grade ti LC-MS (Honeywell). Na peko ti so a sara centrifugation na 21 000 g teti penze-ngbonga 5 na 4°C, a mû 20 μl ti ngu so a zi ni awe ti sara na analyse ti flux ti acide aminé, na a mû tanga ti ngu ni hio ti sara na analyse ti anion (bâ na gbe ni ge). A yeke sara kua na mbeni kode so a fa ni kozo awe ti sara si a-acide aminé abâ gigi (55, 56). Na yâ ti kozo kapa ni, a mû 10μl ti carbonate ti sodium 100 mM (Sigma-Aldrich) na a zia na yâ ti 20μl ti métabolite so a zi na yâ ti ngu ni, na pekoni a zia 10μl ti chlorure ti benzoïle 2% (Sigma-Aldrich) na yâ ti ACN ti grade LC. A mû échantillon ni na vortex kete na pekoni a zia ni na yâ ti centrifuge na g 21 000 teti penze-ngbonga 5 na 20°C. A zia na yâ ti mbeni bozo ti autoéchantillonnage ti 2 ml so a zia na yâ ni mbeni ye so a sara ni na verre so ayeke conique (volume ti 200 μl). A mû a-échantillon ni na lege ti mbeni ye so a iri ni Acquity iClass so ayeke sara kua nzoni mingi (Waters) so abungbi na mbeni ye so a iri ni Q-Exactive (QE)-HF. Ti tene a bâ ni, a zia 2μl ti échantillon so a sara ni na yâ ti mbeni colonne ti silice T3 so ayeke ngangu mingi so ayo 100×1,0 mm (Waters) so na yâ ni a yeke wara akete kete ye so ayo 1,8μm. A yeke 100μl/min, na a yeke wara na yâ ti système ti tampon ni tampon A (10 mM ti formate d’ammonium na 0,15% ti acide formique na yâ ti ngu) nga na tampon B (ACN). Gradient ni ayeke tongaso: 0%B na penze-ngbonga 0; 0%B. 0 ti si na 15% B na penze-ngbonga 0 ti si na 0,1; 15 ti si na 17% B na penze-ngbonga 0,1 ti si na 0,5; B na 17 ti si na 55% na penze-ngbonga 0,5 ti si na 14; B na 55 ti si na 70% na penze-ngbonga 14 ti si na 14,5; na 14,5 ti si na 70 ti si na 100% B na penze-ngbonga 18; 100% B na penze-ngbonga 18 ti si na 19; 100 ti si na 0% B na penze-ngbonga 19 ti si na 19,1; 0% B na penze-ngbonga 19,1 ti si na 28 (55, 56). A yeke na lege ni ti tene e sara kua na spectromètre ti masse ti QE-HF so ayeke sara kua na lege ti ionisation so ayeke na mbeni range ti masse so ayeke m/z (ratio ti masse/charge) so ayeke na popo ti 50 ti si na 750. Résolution so a sara kua na ni ayeke 60 000, na cible ti ion ti komande ti gain (AGC) so a wara ayeke 3×106, na ngoi ti ion so ayeke kota mingi ayeke millico1. A yeke sala kusala na mbeni tension ti spray so ayeke 3,5 kV, mbeni ndowa ti capillaire ti 250°C, mbeni pupu ti fourrure so ayeke 60 AU (unité arbitraire), nga na mbeni pupu ti mungo maboko so ayeke 20 AU. 250°C. A yeke wara na yâ ti S ni 60 AU.
A yeke sara kua na chromatographie anion-MS ti sara kua na a-acide organique so a zia marque na ndo ni 13C. A yeke wara na yâ ti ambeti ti e ambeni ye so a iri ni Dionex 5000+ (ICS 5000+) so abungbi na mbeni spectromètre ti masse ti QE-HF. Na yâ ti kete tënë, a zia 5μl ti mbeni ye so a zi na yâ ti mênë ti zo na yâ ti mbeni colonne ti Dionex IonPac AS11-HC so a sara ni na HPLC (2 mm×250 mm, kota ti akete kete ye ni ayeke 4μm, Thermo Fisher Scientific) na yâ ti mbeni mode ti boucle partiel push-in na mbeni ratio ti remplissage ti 1. 4μm, Thermo ti gingo susu ti senda-ye). A yeke bata wâ ti colonne ni na 30°C, na a yeke zia autoéchantillonnage ni na 6°C. Lo mû mbeni cartouche ti hydroxyde ti potassium so a mû na lo ngu so a zi ion na yâ ni ti sara si mbeni gradient ti hydroxyde ti potassium abâ gigi na lege ti générateur ti éluent. A kangbi yâ ti amétabolite ni na mbeni débit ti 380μl/min, na a sara kua na a-gradient so: 0 ti si na 3 penze-ngbonga, 10 mM KOH; 3 ti si na 12, KOH 10 ti si na 50 mM; 12 ti si na 19, KOH 50 ti si na 100 mM; 19 ti si na penze-ngbonga 21 , KOH 100 mM; 21 ti si na penze-ngbonga 21,5, 100 ti si na 10 mM ti KOH. A kiri a leke colonne ni na gbe ti KOH 10 mM teti penze-ngbonga 8,5.
A yeke wara na yâ ti a-élution ni mbeni 150μl/min ti isopropanol so a mû na peko ti colonne ni na pekoni a yeke gue na ni na mbeni spectromètre ti masse so ayeke na kota résolution so ayeke sara kua na lege ti ionisation négative. MS ayeke bâ lege ti masse so alondo na m/z 50 ti si na 750 na mbeni résolution ti 60 000. AGC ni ayeke 1×106, na ngoi ti ion so ayeke kota mingi ayeke 100 ms. A yeke sala kusala na source ti ESI so ayeke na wâ na mbeni tension ti spray so ayeke 3,5 kV. Ambeni ye so a leke na yâ ti lingu ti ion ni ayeke so: ndowa ti capillaire ni ayeke 275°C; gaz ti fourrure, 60 AU; gaz ti mungo maboko, 20 AU na 300°C, na S so a leke ni na 60 AU.
A yeke wara na yâ ti amétabolite ni 13C. Lo sara kua na logiciel TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) ti gi nda ti asango na ndo ti wungo ti isotope. A bâ mara ti akota ye oko oko na lege ti mbeni bungbi ti référence so zo alingbi ti zia bê na lo na a gi nda ni ala wani. Ti sara si a-isotope ni aga mosoro, a mû ndo ti chromatogramme ti a-ion so a zi ni (XIC) ti isotope oko oko ti 13C (Mn) na yâ ti [M + H] +, so n ayeke wungo ti carbone ti ye so a leke ni, so a sara kua na ni ti bâ na a-acide aminé wala [ MH] + so a sara kua na ni ti gi na a-anion. Masse ti XIC ayeke kete ahon ambage oku na yâ ti million oko, na RT ayeke penze-ngbonga 0,05. A yeke sala kusala na enrichissement na lege ti dikongo wungo ti isotope oko oko so a wara na wungo ti isotope kue ti bungbi so alingbi na ni. A mû a-écart so tongana a-isotope oko oko, na a fa ye so asi tongana a-enrichissement ti pourcentage ti molar (MPE), tongana ti so a fa ni kozo awe (42).
A sara si a-neuron so a sara ni na glace aga homogénéisé na yâ ti méthanol 80% (v/v) so ayeke glacé, a sara si a ngbâ na yâ ti mbeni vortex, na a zia ni na -20°C teti penze-ngbonga 30. Vortex échantillon ni encore na zia ni na yâ ti +4°C teti penze-ngbonga 30. A zia échantillon ni na yâ centrifuge na 21 000 g teti penze-ngbonga 5 na 4°C, na pekoni a bungbi ngu so asigigi na yâ ni na a sala si a sukula ni na lege ti mbeni ye ti SpeedVac so ayeke na 25°C ti tene a bâ ni na pekoni. Tongana ti so a fa na nduzu ge, a sala kusala na LC-MS ti gi nda ti acide aminé ti acellule so a soro ni. Na lege ti TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific), a sala kusala na asango ti gingo nda ti ye na lege ti akota ye so ayeke na yâ ti abungbi oko oko. A yeke na lege ni ti tene a sara kua na logiciel ti preprocessCore (57) ti sara si a-étude ti métabolite ni aga nzoni.
Slice ti lekengo ye. A zia na yâ ti ngbo ni hio mbeni ye so a iri ni dioxyde de carbone na a fâ li ti lo, a zi cerveau ni hio na yâ ti crâne ni, na a sara kua na mbeni épée so ayeke yengi so asi singo na glace (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Allemagne) ti fâ yâ ni na yâ ti 300 ti si na 375 μm ti carbone O5d. CO2). mOsm). A yeke wara na yâ ti ni mbeni chambre so Ca2 + ACSF ayeke dä mingi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, tampon ti phosphate ti sodium 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glucose 25,0 mM, pH42l mM 4,0 mM. na 310 ti si na 320 mOsm). Zia akete kete ye ni teti penze-ngbonga 20 ti si na 30 tongaso si a lingbi ti kiri ti leke ni kozoni si mo enregistré ni.
enregistrement ni. A sala kusala na mbeni stade ti microscope so ayeke na mbeni chambre ti enregistrement so a leke ni nzoni nga na mbeni ye ti bango na ye so a zia na yâ ti ngu fani 20 (Scientifica) teti enregistrement kue. A hinga a-cellule ti Purkinje so a tene a yeke (i) kota ti tere ti zo, (ii) ndo so cerveau ni ayeke dä, nga (iii) fango na gigi gene ti fango tënë ti mtYFP so ayeke za. A yeke wara na yâ ti ambeti ti e ambeni ye so a iri ni capillaire ti verre ti borosilicate (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Produits de la science, Hofheim, Allemagne) nga na mbeni pipette so ayeke na ndö ti sese (P-1000). A yeke na lege ti mbeni logiciel Signal (version 6.0, Cambridge, Royaume-Uni) si a yeke sara enregistrement ni kue. A sara experiment ni na mbeni vitesse ti échantillonnage so ayeke 12,5 kHz. A yeke sala kusala na afiltre use ti Bessel so ayeke na kete ngoi ti sala kusala na a-fréquence ti kongo le-kobe so ayeke 1,3 na 10 kHz. A yeke wara na yâ ti membrane ni na pipette ni mbeni circuit ti compensation so ayeke sara kua na ampli. A sala a-expérience kue na gbe ti komandema ti mbeni caméra Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Zamani), so a sala kusala na logiciel ti Hokawo (version 2.8, Hamamatsu, Gerden, Zamani).
Routine ti lekengo acellule kue na ti gingo nda ti ye. Na ngoi so a yeke sara enregistrement ni, a yeke wara na yâ ti pipette ni aye so: KCl 4,0 mM, NaCl 2,0 mM, EGTA 0,2 mM, gluconate ti potassium 135,0 mM, Hepes 10,0 mM, Guphano.TPG5g 4,0 mM (4,0 mM ATP). (Na) na 10,0 mM ti phosphate ti créatinine so a leke ni na pH 7,25, na pression ti osmotique ni ayeke 290 mOsm (sucrose). Gi kete na peko ti so a sala kusala na mbeni ngangu ti 0 pA ti fâ yâ ti membrane ni, a mû mesure ti ngangu ti membrane so ayeke wu tere. A yeke wara na yâ ti ngu ni akota courant so ayeke na -40, -30, -20, na -10 pA. Mesure ti kota ti réponse ti tension ni na lo sara kua na ndia ti Ohm ti hinga na résistance ti entrée ni. A sû na mbeti aye so asi gi tongaso na yâ ti mbeni pince ti tension teti penze-ngbonga 5, na a hinga sPSC na a mû mesure ni na yâ ti Igor Pro (version 32 7.01, WaveMetrics, Lac Oswego, Oregon, États-Unis) na lege ti mbeni mbeti so ayeke sara kua gi lo oko. A yeke mû courbe ti IV na courant so ayeke ngbâ lakue na place ni na lege so a yeke kanga batterie ni na akota ngangu nde nde (so ato nda ni na -110 mV) na a yeke kono tension ni na yâ ti a-étape 5 mV. A tara ti sala kusala na AP na salango kusala na mbeni courant so ayeke dépolarisé. A yeke wara na yâ ti cellule ni -70 mV na ngoi so a yeke sara kua na mbeni courant so ayeke dépolarisé. A leke kota ti étape ti unité ti enregistrement oko oko nde nde (10 ti si na 60 pA). Calculé kota fréquence ti AP na lege ti maboko ti diko wungo ti a-pulse so ayeke sara si fréquence ti AP ni aga kota. A yeke sara kua na use dérivé ti pulse ti dépolarisation so ayeke sara si AP oko wala mingi abâ gigi.
A yeke sara kua na a-analyse ti perforé. Sara enregistrement ti perforé na lege ti a-protocole so ayeke na lege ni. Lo mû mbeni pipette so ayeke na ATP nga na GTP pëpe so ayeke na aye so: gluconate K 128 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM, EGTA 0,1 mM nga na MgCl2 2 mM, na lo leke ni ti si na pH 7,2 (na lege ti KOH). A yeke zi ATP na GTP na yâ ti solution so ayeke na yâ ti acellule ti tene a kanga lege na perméabilité ti membrane ti acellule ni sân ti tene a kanga lege na ni. A yeke zia na yâ ti pipette ti bongo ni mbeni ye so ayeke na yâ ti ni so ayeke na amphotéricine (ndulu na 200 ti si na 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) ti wara mbeni mbeti ti bongo so a pika ni. A yeke wara na yâ ti a-amphotéricine ni mbeni ye so a iri ni diméthyle sulfoxyde (so wungo ni ayeke 0,1 ti si na 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Akota wungo ti DMSO so a sala kusala na ni ayeke sala ngangu mingi pëpe na ndo ti a-neuron so a manda ye na ndo ni. Na ngoi ti punch ni, a yeke bâ lakue résistance ti canal ni (Ra), na a yeke komanse ti sara experiment ni na peko ti so amplitude ti Ra na AP ni adë (penze-ngbonga 20-40). A yeke mû mesure ti kusala so ayeke si gi tongaso na yâ ti mbeni pince ti tension nga na/wala ti courant teti penze-ngbonga 2 ti si na 5. A sara kua na Igor Pro (version 7.05.2, WaveMetrics, Amerika), Excel (version 2010, Redmond, États-Unis) nga na GraphPad Prism (version 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, Californie). Amerika). Ti hinga a-AP so ayeke si gi tongaso, a yeke sara kua na plug-in ti IgorPro so iri ni ayeke NeuroMatic v3.0c. A yeke hinga a-AP na lege ti mbeni threshold so a mû, so a leke ni oko oko ndali ti enregistrement oko oko. Na lege ti interval ti spike, fa wungo ti apikango ye so ayeke na kota fréquence ti pikango ye na ngoi ni so nga na fréquence ti pikango ye so ayeke na yâ ti moyenne.
PN ti isolement. Na lege ti salango ye alingbi na protocole so a sigigi na ni kozoni awe, a sukula a-PN na yâ cerveau ti ngbo na mbeni ngoi so a fa ni (58). Na nduru tënë, a fâ yâ ti cerveau ni na a fâ yâ ni na yâ ti mbeni ye so a sara ni na glace [so HBSS Ca2+ na Mg2+ ayeke dä pëpe, a zia na yâ ni glucose 20 mM, pénicilline (50 U/ml) nga na streptomycine (0,05 mg/ ml) (0,05 mg/ ml) [], na pekoni a zia na yâ ti ngu ni [mgSSHB-cystéine], papal1. / ml), papaïne (16 U / ml) na désoxyribonucléase I (ADNase I; 0,1 mg/ml)] A yeke sala kusala na ni teti penze-ngbonga 30 na ndo ti 30°C. Kozoni, sukula anyama ni na yâ ti ngu ti HBSS so ayeke na mucus ti œuf (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) nga na DNase (0,1 mg/ml) na yâ ti chambre ti tene a kanga lege na enzyme ti te ye, na pekoni na yâ ti ngu ti HBSS so ayeke na glucose 20 mM), mo fâ yâ ni na ngangu pëpe na yâ ti HBmyl5. (0,05 mg/ml) na DNase (0,1 mg/ml) ayeke zi acellule oko oko. A zia na yâ ti mbeni ye so a iri ni 70μm, na pekoni a sara si a zia na yâ ti mbeni ye so a iri ni centrifugation (1110 rpm, penze-ngbonga 5, 4°C) na a kiri a zia ni na yâ ti mbeni ye so a iri ni 1110 rpm, penze-ngbonga 5, 4°C) na a kiri a zia ni na yâ ti mbeni ye so a iri ni 20 mM ti glucose, 20% ti streptomyline bovine fétal) Sérum, 20%. (0,05 mg/ml)]; ti bâ wala acellule ni ayeke ngbâ na fini na lege ti iodure ti propidium na ti leke wungo ti acellule ni ti si na 1×106 ti si na 2×106 cellule/ml. Kozoni na cytométrie ti flux, a yeke zia na yâ ti mbeni filtre ti cellule so ayo 50 μm.
Cytomètre ti débit. A sara kua na masini ti FACSAria III nga na logiciel ti FACSDiva (version 8.0.1) ti soro acellule ni na 4°C. A leke yâ ti acellule ni na lege ti mbeni buze so ayo 100 μm na gbe ti mbeni pression ti 20 psi na mbeni vitesse ti ~2800 événements/sec. Teti so a-critère ti gating ti kodoro (kota ti acellule, kangbingo popo ti aye use, nga na asarango ye ti kangbingo yâ ti acellule) alingbi pëpe ti sara si a kangbi PN nzoni na ambeni mara ti acellule nde, a leke kode ti gating ni na lege ti hakango mbilimbili ngangu ti YFP nga na autofluorescence na yâ ti mitoYFP+ ​​nga na mitoYFP ti komande. YFP ayeke sala si a zia wâ na ndo ti échantillon ni na mbeni ligne ti laser so ayo 488 nm, na a yeke wara signal ni na lege ti mbeni filtre so ayeke hon na bande ti 530/30 nm. Na yâ ti asusu so ayeke na mitoYFP+, a yeke wara nga ngangu ti gene so ayeke fa tënë ti Rosa26-mitoYFP ti kangbi popo ti ambage ti tere ti neuron nga na ti axon. 7-AAD ayeke sala kusala na mbeni laser jaune ti 561 nm na a yeke wara ni na lege ti mbeni filtre ti bande ti 675/20 nm ti zi na yâ ni acellule so akui awe. Ti kangbi yâ ti astrocyte na oko ngoi ni, a zia na yâ ti acellule ni ACSA-2-APC, na pekoni a zia na yâ ti échantillon ni mbeni ligne ti laser so ayo 640 nm, na a sara kua na mbeni filtre so ayeke hon na bande ti 660/20 nm ti hinga na signal ni.
A bungbi acellule ni na lege ti centrifugation (1110 rpm, penze-ngbonga 5, 4°C) na a bata ni na -80°C juska a sala kusala na ni. A yeke kangbi yâ ti asusu ti Mfn2cKO nga na akete molenge ti ala ti koli na oko lango ni ti tene a sara si a changé pëpe akode ti sarango ye ti ala. A sara kua na logiciel FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, États-Unis) ti fa na azo asango ti FACS nga ti bâ ni nzoni.
Tongana ti so a fa ni na nduzu ge (59), a yeke sala kusala na PCR na ngoi ti tâ ye ti zi ADN na yâ ti a-neuron so a soro ni awe ti tene a hinga wungo ti mtDNA na pekoni. A yeke na lege ni ti tene a sara kua na qPCR na ndö ti wungo ti acellule nde nde. Na nduru tënë, a bungbi PN 300 na yâ ti mbeni tampon ti lyse so ayeke na tris-HCl 50 mM (pH 8,5), EDTA 1 mM, Tween 20 0,5% nga na protéinase K (200 ng/ml) na a zia ni na ndo ti 55°C teti penze-ngbonga 120. A kiri a zia a-cellule ni na ndo ti 95°C teti penze-ngbonga 10 ti tene a sara si a-protéinase K asara kua kue pëpe. A yeke wara na yâ ti a-étude ni Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thérmo Fisher, numéro ti mbeti ti AIVI3E8) nga na 18S (Thérmo Fisher, numéro ti mbeti ti Hs99999901_s1).
A leke échantillon ti protéome. Na lege ti 95°C teti penze-ngbonga 10 na salango kusala na mbeni son, na yâ ti tampon ti lyse [chlorure ti guanidine 6 M, chlorhydrate ti phosphine 10 mM, chloroacétamide 10 mM na pellet ti tris- HC 100 mM na yâ ti neuron so a sala ni na glace]. Na ndo ti Bioruptor (Diagenode) teti penze-ngbonga 10 (poule ti 30 seconde / ngoi ti pause ti 30 seconde). A mû échantillon ni na 1:10 na yâ ti tris-HCl 20 mM (pH 8,0), a mélangé ni na 300 ng ti lor ti trypsine (Promega), na a zia ni na yâ ti mbeni ndo so dê ayeke dä mingi na 37°C ti tene a ngbâ ti te ni kue. Na use lango ni, a zia échantillon ni na yâ centrifuge na g 20 000 teti penze-ngbonga 20. A zia na yâ ti ngu ni acide formique 0,1%, na a zi yâ ti ngu ni na lege ti StageTips so zo asara ni lo wani. A zia échantillon ni na yâ ti mbeni ye ti kua ti SpeedVac (concentrateur ti Eppendorf plus 5305) na 45°C, na pekoni a zia peptide ni na yâ ti acide formique so ayeke na 0,1%. A leke a-échantillon ni kue na oko ngoi ni na lege ti oko zo. Ti tene a bâ yâ ti a-échantillon ti astrocyte, a zia na ndo ni 4 μg ti a-échantillon ti masse ti tandem (TMT10plex, numéro ti catalogue 90110, Thermo Fisher Scientific) so a zia na yâ ti a-échantillon ni mbeni peptide na réactif ti TMT so ayeke 1:20. Ti zia marque na ndo ti TMT, a kiri a zia 0,8 mg ti réactif ti TMT na yâ ti 70 μl ti ACN so ayeke na ngu pëpe, na a kiri a leke peptide so ahule awe ti ga 9 μl ti TEAB 0,1 M (bicarbonate de triéthylammonium), so na yâ ni a zia 7 μl ti réactif ti TMT na yâ ti ACN. Azo ni ayeke 43,75%. Na peko ti so a sara penze-ngbonga 60 awe, a zi yâ ti ngbongboro ngu ni na 2 μl ti hydroxylamine so ayeke na 5%. A bungbi a-peptide so a zia marque na ndo ni, a sara si a sukula, a kiri a zia ni na yâ ti 200μl ti acide formique (FA) 0,1%, a kangbi yâ ni use, na pekoni a zi ingo na yâ ni na lege ti StageTips so zo wani asara. Na lege ti mbeni masini ti chromatographe ti ngu so ayeke na ngangu mingi (UltiMate 3000), a kangbi yâ ti mbeni oko ti ambage use so na ndo ti mbeni colonne ti chromatographie ti Acquity so ayo 1mm x 150mm so asi singo na akete kete ye ti C18 so ayo 130Å1,7μm (NoWaters, catalog150). Thermo Fisher ti senda-ye). A kangbi yâ ti apeptide na mbeni débit ti 30μl/min, a kangbi yâ ti 1% ti si na 50% ti tampon B teti penze-ngbonga 85 na mbeni gradient ti étape ti penze-ngbonga 96, ti 50% ti si na 95% ti tampon B teti penze-ngbonga 3, na pekoni penze-ngbonga 8 teti 95 % ti tampon B; Tampon A ayeke 5% ti ACN na 10 mM ti bicarbonate d’ammonium (ABC), na tampon B ayeke 80% ti ACN na 10 mM ti ABC. A bungbi akete ye na yâ ti penze-ngbonga 3 oko oko na a bungbi ni na yâ ti agroupe use (1 + 17, 2 + 18, na ambeni ye tongaso) na a sukula ni na yâ ti mbeni centrifuge so ayeke na vide.
A yeke sara kua na LC-MS/MS. Ti sara kua na spectrométrie ti masse, a kangbi yâ ti a-peptide (numéro r119.aq) na ndö ti mbeni colonne ti gingo nda ti ye so ayo 25 cm, so diamètre ti yâ ni ayeke 75 μm (fini lentille ti bango na ye, numéro ti mbage ni ayeke PF7508250) so a sara ni na 1,9 μm ti Ma. EASY-nLC 1200 (Mbeti ti senda-ye ti thermo, Zamani). A yeke bata colonne ni na 50°C. A-tampon A na B ayeke 0,1% ti acide formique na yâ ti ngu nga na 0,1% ti acide formique na yâ ti 80% ti ACN, na lege ti mbaï. A kangbi yâ ti apeptide ni na popo ti 6% ti si na 31% ti tampon B teti penze-ngbonga 65 nga na popo ti 31% ti si na 50% ti tampon B teti penze-ngbonga 5 na mbeni gradient ti 200 nl/min. A yeke wara na yâ ti a-élution ni mbeni ye so a iri ni Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). A yeke mû mesure ti m/z ti peptide ni na mbeni résolution ti 120 000 na yâ ti range ti 350 ti si na 1500 m/z. Na lege ti 27% ti ngangu ti tingbingo tele so a leke ni nzoni, a soro ngangu précurseur so ayeke na mbeni état ti charge ti 2 ti si na 6 teti gango na ngangu ti C trap dissociation (HCD). Ngoi ti cycle ni ayeke 1 s. A mû m/z ti mbage ti peptide ni na yâ ti trap ti ion so a sara kua na kete cible ti AGC so ayeke 5×104 nga na ngoi ti injection so ayeke 86 ms. Na peko ti so a kangbi yâ ti aye ni, a zia précurseur ni na ndo ti liste ti azo so a zi ala na yâ ti bungbi ni teti 45 s. A kangbi yâ ti a-peptide so a zia marque na ndo ni na lege ti TMT na ndo ti mbeni colonne ti Acclaim PepMap so ayo 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, numéro ti catalogue 164942), na a bâ a-image ti guengo na ndo nde nde na ndo ti mbeni spectromètre ti masse ti Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific so ayeke na kota ndo). (FAIMS) a-appareil (Thermo Fisher Scientific) ayeke sara kua na a-voltage use ti compensation so ayeke −50 na −70 V. MS3 so a soro ni na lege ti akozo ye so a sara na synchronisation ayeke sara kua na ni ti mû mesure ti signal ti ion ti rapport ti TMT. A kangbi yâ ti peptide ni na lege ti EASY-nLC 1200, na salango kusala na mbeni élution ti gradient ligneux ti 90%, na mbeni wungo ti tampon so ayeke na popo ti 6% ti si na 31%; tampon A ayeke 0,1% ti FA, na tampon B ayeke 0,1% ti FA na 80% ti ACN. A yeke sala kusala na colonne ti analyse ni na 50°C. Lo sara kua na FreeStyle (version 1.6, Thermo Fisher Scientific) ti kangbi yâ ti akozo fichier ni alingbi na tension ti compensation ti FAIMS.
A yeke wara na yâ ti aprotéine ni aye so ayeke na yâ ni. Na lege ti masini ti gingo ye so abungbi na Andromeda, a gi nda ti akozo sango na lege ti MaxQuant version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Na ndo ti akete kete ye so a iri ni Cre recombinase nga na YFP so a wara na yâ ti Aequorea victoria, a gi ti hinga akete kete ye so ayeke na yâ ti a-isoforme ti protéome ti référence ti ngbo (ID ti Protéome UP000000589)77, so a téléchargé ni na UniProt na nze ti mai 2010. A leke oxidation ti méthionine nga na acétylation ti N-terminal ti protéine tongana achangement so ayeke changé; a leke méthylation ti cystéine carbamoyl tongana ambeni ye so a leke ni nzoni. A yeke wara na yâ ti aparamètre ni “spécificité” nga na “trypsine/P”. A yeke wara na yâ ti a-peptide nga na a-peptide ti rasoir so a sara kua na ni ti hinga na aprotéine so ayeke 1; wungo ti akete peptide so ayeke nde ayeke 0. Na gbe ti aye so andu carte ti peptide so alingbi tere, wungo ti aprotéine so a hinga ni ayeke 0,01. A yeke wara na yâ ni “Use Peptide”. Lo sara kua na “match entre runs” ti sara si a-identifiant ni aga nzoni na popo ti a-original nde nde. Lo LFQ kete ratio ti wungo 1 teti wungo ti aye so ayeke na étiquette pëpe (LFQ) (60). A yeke filtré ngangu ti LFQ ti wara kamême akota ngele use so ayeke na lege ni na yâ ti kamême mbeni groupe ti genotype oko na ngoi oko oko, na a yeke extrapolé ni na lege ti mbeni kangbingo ye so ayeke na lege ni so ayeke na mbeni largeur ti. 0,3 na gue na gbe ni 1,8. Lo sara kua na plateforme ti ordinateur ti Perseus nga na R ti bâ na lege ti LFQ. A sara kua na mbeni test ti t so ayeke na lege use so alondo na yâ ti logiciel ti limma ti sara na analyse ti atënë so ayeke nde (61). A yeke wara na yâ ti ambeti ti e ambeni ye so a iri ni ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally nga na pheatmap. A yeke wara na yâ ti ambeti ti e ambeni ye so a iri ni TMT, so a sara kua na version 1.6.10.43 ti MaxQuant. Gi ti wara asango ti proteomique brut na yâ ti base de données ti proteomique ti azo ti UniProt, so a téléchargé ni na nze ti septembre ngu 2018. Analyse ni andu facteur ti correction ti purité ti isotope so azo so asara ni amû. Lo limma na R ti sara na analyse ti atënë so ayeke nde. A yeke bata akozo sango, arésultat ti gingo nda ti ye na yâ ti base ti asango, nga na kusala ti gingo nda ti asango nga na arésultat ni kue na yâ ti bungbi ti ProteomeXchange na lege ti ndo ti batango asango ti PRIDE so ayeke na identifiant ti bungbi ti asango PXD019690.
A-annotation so ayeke sara kua ayeke sara si analyse ni aga nzoni. A sala kusala na gbakuru ti gingo nda ti lege ti ndara (QIAGEN) ti hinga na mosoro ti atënë ti annotation ti kusala ti asango so a bungbi na ayenga 8 (Foto 1). Na nduru tënë, molongo ti aprotéine so a wara na lege ti LC-MS/MS (spectrométrie ti masse tandem) asara kua na a-critère ti filtre so: A soro Mus musculus tongana mara ti nyama ni nga na fondation ni, na a bâ so wungo ti P so Benjamini aleke ni ndali ti enrichissement 0,05 wala na gbe ni ayeke kota ye. Ti graphique so, a fa akota mbage oku so ahon ndo ni na yâ ti agroupe oko oko so aluti na ndo ti ngere ti P so a leke ni. Na lege ti t-test mingi, na lege ti programme ti mungo maboko na azo so ayeke na yâ ti a-étape use ti Benjamini, Krieger, na Yekutieli (Q = 5%), a sara mbeni gingo nda ti ye na ndo ti akota zo so a hinga ala na yâ ti agroupe oko oko, na a gi nda ti molongo oko oko nde nde. A hunda pëpe ti mû mbeni SD so ayeke gue oko.
Ti haka aye so asi na yâ ti étude so na ambeti so a sigigi na ni nga ti sara mbeni diagramme ti Venn na yâ ti tableau 1, a bungbi molongo ti aprotéine so ayeke na yâ ti wungo ti poroso na a-annotation ti MitoCarta 2.0 (24). Lo sara kua na gbakuru so ayeke na ndö ti Internet Dessiné diagramme de Venn ( http://bioinformatique.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ti sara na diagramme ni.
Ti wara anzene nzene tënë na ndo ti akode ti dikongo wungo ti azo so a sara kua na ni ti gi nda ti aye na lege ti proteomique, bâ mbage so ague oko na ni so ayeke na yâ ti mbeti Matériaux et méthodes. Ti tanga ti a-expérience kue, a lingbi ti wara anzene nzene tënë na yâ ti mbaï so alingbi na ni. Tongana a fa mbeni ye nde pëpe, a fa asango kue tongana moyenne ± SEM, na a sala a-analyse ti statistique kue na lege ti logiciel GraphPad Prism 8.1.2.
Ti wara ambeni ye nde ti wara na yâ ti article so, bâ ndo na ndo ti site ti e.
A yeke mbeni article so azo kue alingbi ti wara ni so a kangbi ni na gbe ti andia ti Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, so amû lege ti sara kua na ni, ti kangbi ni nga ti kiri ti sara ni na mbeni lege nde, gi tongana ndangba kusala ni ayeke pëpe ti wara na nginza nga so ye so a fa ayeke so kozo mbeti ni ayeke na lege ni. Zo ti ba.
Note: E hunda gi na mo ti mû adresse e-mail ti mo tongaso si zo so mo recommandé lo na ndö ti page ni ahinga so mo ye ti tene lo bâ e-mail ni nga so a yeke spam ape. A yeke mû ande pëpe adresse ti e-mail.
A yeke sara kua na hundango ndo so ti tara wala mo yeke mbeni vizite nga ti kanga lege na tokuango asango ti spam automatiquement.
A yeke na lege ni ti tene e sara tënë ti E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Mbeni gingo nda ti ye na ndo ti a-neuron so ayeke sara kua nzoni pëpe afa so a yeke sara kua na aprogramme ti métabolisme ti kanga lege na kobela ti li.
A yeke na lege ni ti tene e sara tënë ti E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Mbeni gingo nda ti ye na ndo ti a-neuron so ayeke sara kua nzoni pëpe afa so a yeke sara kua na aprogramme ti métabolisme ti kanga lege na kobela ti li.
©2020 Bungbi ti Amerika ti guengo na li ni ti senda-ye. a yeke bata droit kue. AAAS ayeke mbeni mba ti HINARI, AGORA, OARE, CHORALE, CLOCKSS, CrossRef na COMPTEUR. ISSN 2375-2548 ti senda-ye.