Fadeso†Adresse ti fadeso: OX11 0DE, Royaume-Uni, Da ti Diamant, Parc ti senda-ye na ti lekengo ye ti Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Royaume-Uni, Co.
Centre ti réaction so ayeke bungbi lumière 1 (RC-LH1) ayeke kota mbage ti photosynthèse ti a-bactérie so ayeke te lumière so ayeke violet. A yeke wara na yâ ti a-appareil ni ambeni ye use so ayeke na yâ ti a-appareil ti RC-LH1 so alondo na Rhodopseudomonas palustris. A yeke wara na yâ ti RC-LH114-W a-unité 14 ti LH1 so ayeke na yâ ti RC, so a fâ yâ ni na lege ti protéine W, na ngoi so a yeke wara na yâ ti RC-LH114-W ni aye so ayeke na yâ ti RC. A yeke 16 sous-unité LH1 boucle. Na ngoi so a haka aye so, a mû lege ti hinga ye na ndo ti ngangu so quinone ayeke sara na yâ ti RC-LH1, so na popo ni a yeke wara achangement ti conformation so a hinga ni kozo pëpe na ngoi so a yeke bungbi quinone na ndo ti RC QB, nga na ndo so a yeke wara a-auxiliaire ti quinone, so ayeke mû maboko ti tene a Pass ala na RC. Mbeni ye so ayeke nde so ayeke na yâ ti protéine W akanga lege na boucle ti LH1 ti kanga lege na ni, na tongaso a leke mbeni lege ti tene a sara si quinone/quinolone achangé hio.
Ngangu so photosynthèse ayeke mû alingbi ti bata ndulu na aye kue so ayeke na fini na ndo sese, na a yeke na kota ngangu teti biotechnologie ti lâ. Na ngoi so ala yeke mû maboko na photosynthèse ti sese kue, a-bactérie so ayeke te fototrophe ti violet ayeke fa nga alege nde nde ti ngangu nga na ngangu ti ala ti gbian yâ ti aye. Ala lingbi ti kpe photosynthèse na ti maï tongana a-hétérotrophe na yâ ti bingo, ala lingbi ti leke azote na gaz carbonique, ti sigigi na hydrogène nga ti buba yâ ti a-arome (1-3). Ti tene a mû ngangu na aye so, a lingbi a changé lumière hio nga nzoni ti ga ngangu ti chimie. A yeke to nda ti sala kusala na ni na ngoi so bungbi ti antenne so ayeke gbu lumière ayeke mû lumière na ayeke mû ngangu so a gbu ni na yâ ti centre ti réaction (RC), na tongaso a yeke to nda ti kangbi yâ ti charge (4 – 7). Kota ye so ayeke sara si lumière ayeke sara kua na yâ ti a-bactérie so ayeke te lumière so ayeke violet ayeke mara ti 2 RC, so angoro ni na mbeni ye so ayeke mû lumière 1 (LH1), so ayeke sara si a yeke wara kota ye ti RC-LH1. LH1 ayeke na lege ti mbeni bungbi ti ahétérodimère αβ so ayeke courbe, so oko oko abungbi chlorophylle (BChl) use ti mbeni molecule nga na mbeni caroténoïde oko wala use (8-12). A yeke wara na yâ ti a-antenne ti LH1 so ayeke ngangu pëpe a-hétérodimère αβ 16 wala 17 so angoro RC (9-13) na yâ ti mbeni boucle so a kanga ni, me na yâ ti ambeni kota ye, a-peptide so ayeke na yâ ti membrane ayeke kanga lege na guengo na li ni ti LH1 so ayeke na terê ni , Na lege so, a yeke sara si quinol/quinone nga na bRC1c11 ayeke kangbi yâ ti terê ti ala. 13-15). Mbeni keke so ayeke te lumière so ayeke violet Rhodopseudomonas (Rps.) ayeke mbeni tapande ti ye so alingbi ti hinga ngangu nga na lege so a-électron ayeke hon na ni so ayeke mû maboko na fotosynthèse. Kozoni, a yeke wara na yâ ti cristal ni Rps. Modèle ti palustris RC-LH1 ayeke RC, so angoro ni na akete boucle hétérodimérique LH1 15, so a kanga lege na ni na mbeni protéine so zo ahinga ni pëpe so a iri ni “Protéine W” (14). Na pekoni, a hinga protéine-W tongana RPA4402, so ayeke mbeni protéine so a sara ni na 10,5 kDa so ayeke na a-hélice ota so a fa ni kozo awe (TMH) (16). A leke ti tene a changé iri ti gene ti rpa4402 so ayeke codé protéine W ti ga pufW ti tene a lingbi na iri so a sara kua na ni ndali ti agene so ayeke codé a-unité RC-L, M (pufL, pufM) nga na LH1α, β (pufA, pufB). Ye ti dongo bê ni ayeke so, protéine-W ayeke gi na yâ ti ndulu na 10% ti RC-LH1, so afa Rps. palustris ayeke sigigi na abungbi ti RC-LH1 use so ayeke nde nde. Na ndo so, a fa peko ti akota ye use so ayeke na yâ ti cryo-EM (cryo-EM) so ayeke na akota ye use, oko ayeke na protéine W nga na ahétérodimère αβ 14, mbeni ayeke na protéine W pëpe nga na mbeni boucle LH1 so ayeke na ahétérodimère 16 so a kanga ni. A leke ni ti fa mbeni gbiango ye na yâ ti hingango ye ti RC-LH1 ti Rps. palustris, ngbanga ti so a gi nda ti wungo ti azo so ayeke legeoko na yâ ti a-variante oko oko na a yeke na résolution so alingbi ti mû polele peptide oko oko nga na a-pigment so abungbi nga na a-lipide nga na a-quinone so ague oko na ni. Tongana a haka abungbi ti aye so, a yeke wara a-protéine ota ti TMH-W so a wara ni pëpe na yâ ti ambeni bungbi ti RC-LH1 juska fadeso ayeke sara si mbeni lege ti quinone abâ gigi ti sara si quinone/quinolone achangé hio. A wara gbâ ti ando so abungbi a-lipide na a-quinone so a bata ni nzoni, na a fa mbeni fini gbiango ye na yâ ti conformation na peko ti so a bungbi quinone na RC, so alingbi ti lingbi na photosystème II (PSII) RC ti anyama so ayeke te oxygène. Ye so e wara amû lege na e ti hinga afini ye na ndo ti lege so quinone/quinolone ayeke tingbi tere nga na échange na yâ ti RC-LH1 so ayeke na yâ ti a-bactérie so ayeke te lumière so ayeke violet.
Ti tene a sara si a yeke ngangu pëpe ti manda anzene nzene ye na ndo ti akota ye use so a wara na yâ ti Rps. palustris, a yeke kangbi yâ ti RC-LH1 oko oko na lege ti akode ti biochimie. A zi poroso so ayeke na yâ ti protéine W (so a iri ni na pekoni ΔpufW) na yâ ti mara ti nyama so ayeke na gene ti pufW pëpe (16), na a lingbi ti sara gi mbeni poroso oko so ayeke na yâ ti RC-LH1. A yeke mbeni mara ti nyama si ayeke sara si a yeke wara protéine W so ayeke na yâ ti ni. A yeke gbian protéine W ti mara so na mbeni marque His 10x na C-terminus ti lo, tongaso si a lingbi ti bungbi nzoni mingi complexe so ayeke na protéine W na mingi ti aprotéine W so ayeke dä pëpe na lege so a yeke sala si wen ni akpengba pëpe. A yeke sara si a yeke ngangu pëpe ti kangbi yâ ti aye ni (16) Chromatographie d’affinité (IMAC).
Tongana ti so a fa na yâ ti tableau 1, abungbi use so kue ayeke na akete unité ota ti RC (RC-L, RC-M na RC-H) so angoro ni na mbeni antenne ti LH1. Na yâ ti 2,80-A ti complexe so ayeke na protéine-W pëpe, a yeke wara ahétérodimères αβ 16, so asara si mbeni boucle ti LH1 so a kanga ni angoro RC kue, so a iri ni na pekoni complexe ti RC-LH116. A leke yâ ti 2,65Å ti protéine-W so ayeke na yâ ti mbeni hétérodimere LH1 so ayeke na 14 so a fâ yâ ni na protéine-W, so a iri ni na pekoni RC-LH114-W.
(A na B) Fango ye na ndo ti composé ni. (C na D) A-pigment so abungbi oko so a fa ni na yâ ti akeke. (E na F) Abungbi so a bâ ni na ndo ti cytoplasme ayeke na a-peptide nga na akete kete ye ti LH1 so a fa ni na yâ ti adessin animé, na a zia wungo ni na mbage ti l’heure ti londo na popo ti protéine-W [so ague oko na wungo ti Rba. sphaéroïde so ayeke na yâ ti ngu (13)]. Ti LH1-α, couleur ti kete mbage ti protéine ni ayeke jaune; ti LH1-β, couleur ti kete mbage ti protéine ni ayeke bleu; ti protéine-W, protéine ni ayeke rouge; ti RC-H, a yeke cyan; ti RC-L, a yeke Orange; ti RC-M, a yeke marge. A yeke wara a-cofacteur na lege ti akeke, vert ayeke a-molécule ti BChl na BPh a, violet ayeke a-caroténoïde, na jaune ayeke a-molécule ti UQ10. (G na H) Akota ye so ayeke na yâ ti protéine-W so ayeke na yâ ti a-équivalent ti RC-LH114-W (G) nga na ti RC-LH116 (H). A yeke fa a-cofacteur na lege ti aye so ayeke mû ndo, a yeke fa a-quinone chélaté na bleu. A fa kangbi so ayeke na popo ti protéine-W na lege ti mbeni ligne ti bleu so ayeke na (G), na akete dû so quinone/quinolol ayeke kangbi na ndo ti bague ti LH116 ayeke na mbeni ligne ti noir na (H).
Figure 1 (A na B) afa RC so angoro ni na abungbi ti hétérodimères ti LH1αβ so a zi wala a kanga, so oko oko abungbi BChl use nga na mbeni caroténoïde (Foto 1, C na D). Azo so asara étude kozo afa so Rps ayeke complexe ti LH1. Na yâ ti lege ti biosynthèse ti spiruline xanthine, mara ti akeke so ayeke na gbâ ti a-caroténoïde so abungbi (17). Ye oko, spiropyrroxanthine ayeke kota ye so ayeke na yâ ti caroténoïde so ayeke na yâ ti mênë ti zo. Tongaso, a soro ti sara kua na spiroxanthine na ando kue so LH1 ayeke bungbi dä. A-polypeptide alpha na béta ayeke a-TMH so ayeke gi oko oko so ayeke na akete membrane ti gigi (Foto 1, A, B, E, na F). Atâa so a yeke wara pëpe gbâ ti arésidu 17 so ayeke na C-terminus, a kangbi yâ ti polypeptide alpha so alondo na Met1 ti si na Ala46 na yâ ti acomplexe use so kue. A yeke wara na yâ ti RC-LH116, a yeke wara na yâ ti RC-LH116, a yeke wara na yâ ti RC-LH116, a yeke wara na yâ ti RC-LH114-W. A yeke wara pëpe gbâ ti akete kete ye 3 wala 4 so ayeke na yanga ti N wala 13 so ayeke na yanga ti C (Foto S1). Na lege ti spectrométrie ti masse ti bungbi ti RC-LH1 so a leke ni na lege ti mara ti nyama ti ngonda, a fa so ndo so amanke ayeke na peko ti so a kangbi yâ ti apeptide so na lege ti hétérologue (Foto S1 na S2). A yeke wara nga na yâ ni formylation ti N-terminal ti α-Met1 (f). Azo so abâ ni afa so α-peptide ni ayeke na arésidu fMet1 ti si na Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, na β-peptide ni ayeke na arésidu Ser2 ti si na Ala53, so ague oko nzoni na carte ti densité ti EM so ayeke na gbe ti ngu.
Ti sara si α-His29 na β-His36 asara kua maboko na maboko asara si BChls ayeke tingbi lê na lê; hétérodimère αβ oko oko abungbi na amba ti lo ti sara mbeni boucle so a zi ni (RC-LH114-W) wala mbeni boucle so a kanga ni (RC-LH116) so angoro RC A-exciton so abungbi pigment (Foto 1, C na D). Tongana a haka ni na bande ti 877 nm ti RC-LH114-W, a yeke wara 880 nm ti RC-LH116 so ayeke na 3 nm (Foto 2A). Me, spectre ti dichroïsme circulaire ni ayeke ndulu ti duti oko (Foto 2B), so afa so atâa so kangbi ayeke polele na popo ti abongo so a zi ni na so a kanga ni, ndo so BChls ayeke dä ayeke tâ gi oko. A lingbi ti tene so redshift ti absorption ni ayeke ndali ti so mouvement ti thermique ni ayeke kiri na peko nga so lo yeke ngbâ lakue nzoni na ndo ti boucle so a kanga ni (18, 19), changement so ayeke na yâ ti couplage ti pigment so aga na lege ti boucle so a kanga ni (20, 21), wala ndali ti so aye use so abungbi (11).
(A) A yeke wara na yâ ti a-absorption ti ultraviolet/visible/proche-infrarouges, so a zia marque na ndo ti akota ye so alingbi na ni na a normalisé ni na akota ye ti BPh so ayeke na 775 nm. (B) A yeke wara na yâ ti spectre ti dichroïsme so ayeke normale ti tene a mû BChl na 805 nm. (C na D) A soro a-écran ti ΔA na yâ ti a-écran ti absorption so a leke ni na ngoi ti RC-LH114-W (C) nga na ti RC-LH116 (D). Ti tene a lingbi ti haka ni nzoni, a yeke sara si a-spectre kue aga normale na ∆A ti −A na 0,2 ps. (E) Wungo ti oxidation ti cytochrome c2 na peko ti so a sara irradiation na yâ ti akota bungbi nde nde ti UQ2 (bâ tableau S8 ti wara asango so ayeke na yâ ti ngu). (F) Na yâ ti acellule so akono na gbe ti lumière so ayeke ngangu mingi pëpe, so ayeke na popo-hoto wala so ayeke ngangu mingi (10, 30 wala 300μMm-2 s-1, na lege ti mbaï), a yeke wara akete kete ye ti protéine W na ti RC-L so ayeke na yâ ti complexe so a sukula ni awe nga na akota membrane so a kangbi yâ ni. A yeke wara na yâ ti a-électrophorèse ti gel ti SDS-polyacrylamide nga na a-immunoassay (bâ tableau S9 ti wara asango so a mû na ala). Fa wungo ti azo so ayeke na yâ ti RC-LH114-W so a sukula ni awe. Ratio ti stéchiométrie ti RC-L na protéine-W ti yâ ti complexe ni ayeke 1:1.
A-BChl so ayeke na place 1 na yâ ti boucle αβ14 ti RC-LH114-W (Foto 1, A, C, na E) so ayeke nduru mingi na kozo zo so amû mênë ti RC (P) na 6,8Å ahon a-BChl so ayeke na yâ ti RC-LH116 (Foto 1, B, S3); me, a yeke wara na yâ ti RC-LH114-W na RC-LH116, a yeke wara na yâ ti RC-LH114-W na RC-LH116, a yeke wara 40 ±4 na 44±3 ps (Foto 2). , C na D, Tapande S4 na Tableau S2). A yeke nga pëpe mbeni kota kangbi na yâ ti transfert électronique na yâ ti RC (Foto S5 nga na ambeni mbeti so andu ni). A yeke na lege ni ti tene so ngoi ti kangbingo ngangu na popo ti LH1 na RC-P ayeke ndali ti so yongo, angle nga na ngangu ti ngangu ti mingi ti BChl so ayeke na yâ ti a-boucle use ti LH1 ayeke legeoko. A yeke mo bâ mo tene a yeke gi ti hinga lege ti ngangu ti LH1 ti si na kete ndo so ayeke ngangu pëpe ti mû ngangu directement na ando so ayeke suboptimal ti gue na ni na RC. Na yâ ti RC-LH114-W, a lingbi nga ti sara mbeni mouvement ti chaleur so ayeke kota pëpe na gbe ti akota ndowa ti tene a sara analyse ti structure ni, na a yeke wara mbeni yongoro conformation ti bague αβ14 na température ti chambre so alondo na yongo ti pigmentation ti βBChls so ayeke na place ti RC 1.
Na yâ ti RC-LH116, a yeke wara a-BChl 32 nga na a-caroténoïde 16, na lege so a leke na ni kue ayeke oko na ti so a wara na yâ ti a-pidpidum ti Thermochromatium (Tch.) [Banque de données sur les protéines (PDB) ID 5Y5S (9), tiorhodovibrio. (12) na akeke ti mburu (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Na peko ti so a leke ni, a bâ gi akete ye so ayeke nde na yâ ti ahétérodimère ti αβ, mbilimbili 1-5, 15, na 16 (Foto S6). Ti wara protéine-W ayeke sara ngangu mingi na ndo ti lekengo tere ti LH1. A yeke wara na yâ ti a-TMH ota ti lo ambeni kete boucle, na N-terminal ni ayeke na mbage ti lumière ti complexe ni nga C-terminal ni ayeke na mbage ti cytoplasme ni (Afoto 1A na 3, A ti si na D). Protéine-W ayeke mingi ni hydrophobe (Foto 3B), na TMH2 na TMH3 ayeke sala kusala maboko na maboko na LH1αβ-14 ti sala si a leke mbeni ye so ayeke na yâ ti membrane (Foto 3, B na E ti si na G). A yeke wara na yâ ti a-interface ni akota ye so a iri ni Phe, Leu na Val so ayeke na yâ ti a-région ti transmembrane. A yeke wara na yâ ti a-acide aminé so ayeke hydrophobe nga na a-pigment αβ-14. Ambeni ye so ayeke na yâ ti polaire ayeke mû nga maboko ti tene a sara kua maboko na maboko, so na popo ni a yeke wara kamba ti hydrogène so ayeke na popo ti W-Thr68 na β-Trp42 so ayeke na ndo ti akota dû ti ngu (Foto 3, F na G). Na ndo ti cytoplasme ni, Gln34 ayeke na yâ ti groupe ti keto ti a-caroténoïde αβ-14. Na ndo ni, a leke yâ ti molecule ti n-dodécyl β-d-maltoside (β-DDM), na ngbongboro ti lo so ayeke sara si ngu alï pëpe juska na popo ti protéine-W na αβ-14, na ngbongboro ti lipidi alingbi ti duti na yâ ti tere ti zo. A bâ nga so arégion ti résolution C-terminal ti protéine W na RCH ayeke ndulu mingi, me pëpe na yâ ti kapa ti lekengo ambeni mbilimbili ye so ayeke sala kusala maboko na maboko (Foto 1, A na E). Ye oko, ambeni ye alingbi ti si na yâ ti a-acide aminé C-terminal ti aprotéine use so so a leke ni pëpe, so alingbi ti mû lege ti wara aprotéine-W na ngoi ti bungbingo ti RC-LH114-W.
(A) Protéine-W, so ayeke na mbage ti LH1αβ14 na lege ti dessin animé, ayeke na mbeni chaîne ti mbage so ayeke tongana mbeni keke (rouge), so a fa ni na yâ ti mbeni mbage ti diagramme ti ngangu ti électrostatique (mbeni ye so ayeke gris so ayeke polele na so niveau ti contour ni ayeke 0,13). (B) Protéine-W so a fa ni na lege ti mbeni ye so ayeke na couleur so ayeke hydrophobe. A fa ando so ayeke polaire nga na so ayeke na charge na couleur cyan, ando so ayeke hydrophobe na couleur vuru, na ando so ayeke hydrophobe ngangu na couleur orange. (C na D) Protéine-W so a fa ni na yâ dessin animé, ndo so lo yeke dä ayeke legeoko na ti (A) (C), na a tourné ni na 180° (D). Na lege ti ndo so ala yeke dä na yâ ti molongo ni, a ngbâa so a lingbi ti kangbi popo ti ala ayeke mû mbeni couleur ti arc-en-ciel, so na yâ ni N-terminal ni ayeke bleu na C-terminal ni ayeke rouge. (E) Protéine-W na yâ ti oko bango ndo so ayeke na yâ ti (A), na angbâa so ayeke na popo ti protéine-W:LH1 ayeke na akeke so a zia marque na ndo ni. (F) Protéine-W ayeke tourné 90° na mbage ti (E) na LH1αβ14 na yâ ti dessin animé ni, na a yeke na yâ ti arésidu ti interface ni na yâ ti barre ni. A yeke zia marque na ndo ti angbele ye so ayeke na yâ ti polypeptide beta. A fa cofacteur ni tongana mbeni barre so alingbi na couleur ti tableau 1, a fa β-DDM so abuba awe na couleur ti gris, na a fa oxygène ni na couleur rouge. (G) A bâ ye so ayeke na yâ ti (F) ni na 180°, na a yeke wara akota mbage ti polypeptide alpha so a sû iri ti lo na ndo ni.
Protéine-W ayeke mû place ti mbeni hétérodimère αβ (so ayeke 15 ni na yâ ti tableau 1F), tongaso a yeke kanga lege na kangango lege ti boucle ni nga ti penché akozo hétérodimère ota ti αβ. A bâ so kota angle ti inclinaison ti kozo hétérodimere ti αβ-1 so ague oko na normale ti film ni ayeke 25° ti si na 29° (Foto 1, A na E), so a leke ni na lege ti inclinaison ti 2° ti si na 8° ti αβ-1 na yâ ti RC A sharp contrast-LH116 (Foto 1, B). Use na ota hétérodimère ni ayeke na 12° ti si na 22° nga na 5° ti si na 10°. Na lege ti stérique ti RC, inclinaison ti αβ-1 ayeke pëpe na yâ ti use paire ti αβ (so alingbi na 16e αβ so ayeke na yâ ti tableau 1F), na tongaso a yeke sara si mbeni dû so ayeke polele na yâ ti bague ti LH1 (tableau 1, A na E) . Ndali ti so a yeke wara pëpe a-hétérodimère use ti αβ, so ague oko na futingo ti BChl osio nga na a-caroténoïde use, mbeni oko ti a-caroténoïde ni so abungbi pëpe na kete mbage ti αβ-1 so a tourné ni, na ye so asara si a wara mbeni bague ti LH114-W so ayeke na a-caroténoïde 13 ti Végétarien nga na a-BChl 28. A-étude ti résolution ti ndo ni so ayeke na yâ ti arégion αβ1 ti si na 7 ayeke kete ahon ti tanga ti boucle ti LH1, so alingbi ti fa plasticité so ayeke na yâ ti kete mbage ti LH1 so ayeke na tere ti ndo ti RC QB (Foto 4) .
A fa afoto ti RC-LH114-W (A na B) na ti RC-LH116 (C na D) na lege ti oko bango ndo ti nduzu/na mbage ti tele (A na B) (A na C) nga na ndo ti dû ti ngu ti Fig. 1. (B na D). A yeke fa a-clé so ayeke na couleur na mbage ti koli.
Mbeni oko ti akota ye so ayeke na yâ ti ngbongboro ngbongboro ye so ayeke na yâ ti ngbongboro ngbongboro ngbongboro ngbongboro ngbongboro ngbongboro ngbongboro ngbongboro ngbongboro ngbongboro ngbongboro ngbongboro ngbongboro (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Me, protéine W na PufX ayeke na mbeni ye so ayeke polele pëpe so ala yeke oko, na ala yeke sara ngangu mingi na ndo ti abungbi ti LH1 ti ala oko oko. PufX ayeke mbeni TMH oko so ayeke na mbeni domaine ti cytoplasme so ayeke na yanga ti N so ayeke sara kua na mbage ti cytoplasme ti kete mbage ti RC-H (13) na mbeni ndo so alingbi na Rps. a yeke wara na yâ ti ni LH116αβ-16. PufX aleke mbeni lege ti tene a changé quinone/quinolone na popo ti RC-LH1 na cytochrome bcl na a yeke na yâ ti Rba kue. sphaéroïdes so ayeke na yâ ti ngu (13). Atâa so kue, a yeke wara monomère na monomère na yâ ti Rba. Dimere ti sphaéroïdes RC-LH1-PufX ayeke na ndo ti bungbingo ti protéine W na yâ ti RC-LH114-W, na kangbi so ayeke na popo ti PufX na protéine-W ayeke na ndo so alingbi tere (Foto S7A). A yeke wara nga na yâ ti RC-LH114-W a-hypothèse ti quinone (8) ti Pseudomonas rosea LH1, so a leke ni na lege ti a-peptide so ayeke na kamba pëpe na protéine W wala PufX (Foto S7B). Na ndo ni, a yeke wara na yâ ti Blc. LH1 so ayeke vert émeraude so a leke ni na ziango na gigi mbeni kete mbage ti γ (7) ayeke na yâ ti mara ti ndo so (Foto S7C). Atâa so a yeke na lege ti aprotéine nde nde si ayeke sara kua, bango ndo ti a-quinone/quinolol so ayeke na yâ ti mbeni ndo so ayeke oko na yâ ti RC-LH1 ayeke mo bâ mo tene a yeke mbeni tapande ti évolution convergente, so afa so kangbi so protéine W asara alingbi ti sara kua tongana mbeni lege ti quinone.
Akete kete ye so ayeke na yâ ti boucle ti LH114-W amû lege ti leke mbeni ndo ti membrane so ayeke gue na li ni na popo ti ndo so ayeke na yâ ti complexe ti RC-LH114-W na membrane ti kota ni (Foto 1G), ahon ti tene a bungbi ando use so na lege ti mbeni pore ti protéine tongana ti so a yeke sara ka na yâ ti aprotéine. RC-LH116 ayeke tongana mbeni Tch so a kanga ni. A yeke tongana a-aigui (22) (Foto 1H). Teti so kangbingo yâ ti quinone na yâ ti membrane ni ayeke gue hio ahon kangbingo yâ ti kete lege ti protéine ni, boucle ti LH114-W so azi alingbi ti mû lege na RC ti sara kua hio ahon boucle ti LH116 so a kanga ni, na kangbingo yâ ti quinone na yâ ti RC alingbi ti duti ngangu mingi. Ti tara ti bâ wala protéine W ayeke sara ngangu na ndo ti gbiango ti a-quinone na lege ti RC, a sara mbeni test ti oxidation ti cytochrome na ndo ti mbeni wungo ti ubiquinone 2 (UQ2) (mbeni analogue ti UQ10 so ayeke na lege ni so ayeke na mbeni ngbongboro ngbongboro isoprène) (Foto 2E). Atâa so a yeke wara na yâ ti quinone so a sara ni na chélé akanga lege na zo ti hinga tâ ye so ayeke na yâ ti mênë ti lo (RC-LH114-W na RC-LH116 alingbi na 0,2±0,1μM nga na 0,5±0,2μM, na lege ti mbaï), wungo ti azo so ayeke na yâ ti RC-LH2.RC114-01 ayeke s. 28±5% ti akota ye so ayeke na yâ ti RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
A yeke na lege ni ti tene so protéine-W ayeke na yâ ti 10% tongaso ti akota ye so ayeke na yâ ti terê ti zo (16); na ndo so, wungo ti azo so ayeke na yâ ti acellule so ayeke na lumière mingi pëpe, so ayeke na popo-hoto nga na so ayeke na kota lumière ayeke 15±0,6%, 11±1% nga na 0,9±0,5, % (Foto 2F). Na ngoi so a sara comparaison ti spectrométrie ti masse, a fa so ziango na ndo ni tag ti histidine asara pëpe si wungo ti protéine-W so ayeke na yâ ti anyama ti ngonda adë (P = 0,59), tongaso a-niveau so ayeke pëpe mbeni ye so a sara ni na protéine-W so a changé ni (Foto S10). Ye oko, kete wungo ti protéine-W so ayeke na yâ ti RC-LH1 alingbi ti mû lege na ambeni RC ti kiri na peko hio, na tongaso a yeke sara si a yeke ngangu pëpe ti tene a changé quinone/quinolone na yâ ti RC-LH116. A bâ so wungo ti azo so ayeke na lumière mingi ague oko pëpe na asango so a wara na yâ ti transcriptomique so ade ti ninga pëpe, so afa so fango peko ti agene ti pufW ayeke gue na li ni na gbe ti ngangu lumière (Foto S11) (23). Kangbi so ayeke na popo ti pufW transcription na protéine-W so a zia na yâ ti RC-LH1 ayeke sara si zo agi bê ti lo nga alingbi ti fa so poroso ni ayeke sara kua nzoni.
Na yâ ti RC-LH114-W, a mû na ala a-cardiolipine (CDL) 6, a-phosfatidylcholine (POPC) 7, a-phosfatidylglycérol (POPG) 1 nga na a-β-DDM 29 na a sara si a-molécule ti β-DDM 29 abâ gigi na a sara si a-molécule ti β-DDM 6, a-POPC 24, a-POPGDM 2 nga na a-POPGDM 12 abâ gigi. RC-LH116 (Foto 5, A na B). Na yâ ti abungbi use so, CDL ayeke ndulu ti duti na mbage ti cytoplasme ti complexe ni, na POPC, POPG na β-DDM ayeke mingi ni na mbage ti luminal. A yeke wara a-lipide use nga na a-détergent na yâ ti a-αβ-1 ti si na αβ-6 ti RC-LH114-W (Foto 5A), na a yeke wara oku na yâ ti a-équivalent ti RC-LH116 (Foto 5B ). A wara gbâ ti a-lipide na mbage ti complexe ni, mingi ni CDL, so abungbi na popo ti RC na αβ-7 ti si na αβ-13 (Foto 5, A na B). Ambeni lipidi nga na a-détergent so a leke ni na lege ti structure ayeke na gigi ti bague ti LH1, na a-chaîne ti acyl so a leke ni nzoni ayeke gue na popo ti akete kete ye ti LH1, so a iri ni tentative tongana β-DDM na yâ ti RC-LH114-W, na a fa nda ni tongana β-DDM na yâ ti RC A mélange ti βPOPC-DHDM na 176. A yeke wara na yâ ti a-lipide so ayeke sara si a-lipide nga na a-détergent ayeke na yâ ti a-appareil ti e afa so ala yeke a-appareil so ayeke sara si a-appareil ti terê ti zo aga nzoni (Foto S12A). Akete kete ye so ayeke na yâ ti Tch ayeke nga na nzoni songo. Douce na Trv. 970 RC-LH1s (Foto S12, B ti si na E) (9, 12) na a ngbâa ti hydrogène so abungbi na yâ ti groupe ti li ti lipidi afa so a bata ni nzoni na yâ ti alignement ti molongo ti aye (Foto S13), so afa so a bata CDL so abungbi na RC (24), asite so alingbi ti duti na yâ ti comp- HRCx.
(A na B) A fa a-peptide ti RC-LH114-W (A) na RC-LH116 (B) na lege ti dessin animé, na a fa a-pigment ni na lege ti akeke, na salango kusala na couleur so ayeke na yâ tableau 1. A fa a-lipide na couleur rouge, na a fa a-détergent na couleur gris. UQ so abungbi na asite ti RC QA na QB ayeke jaune, na UQ so ayeke nde ayeke bleu. (C na D) A yeke oko bango ndo ti (A) na (B), na a zi a-lipide na yâ ni pëpe. (E ti si na G) Akota bango ndo ti Q1(E), Q2(F) na Q3(G) so alondo na RC-LH116, na akete chaîne ti mbage so ayeke sala ngangu na ndo mba. A fa abungbi ti hydrogène ni tongana akete ligne ti noir.
Na yâ ti RC-LH116, RC QA na QB UQ, so ayeke mû mbage na yâ ti kusala ti kangbingo yâ ti a-électron, ayeke buba na yâ ti ando so ala yeke tingbi tere dä. Me, na yâ ti RC-LH114-W, a leke QB quinone pëpe na a yeke sara tënë na ndo ni na yâ ti ambeni tënë na gbe ni ge. Na ndo ti a-quinone ti QA na ti QB, a yeke wara a-molécule use ti UQ so a sara ni na chelate (so ayeke na popo ti a-anneau ti RC na ti LH1) na yâ ti structure ti RC-LH114-W alingbi na agroupe ti li ti ala so a leke ni nzoni (so ayeke na yâ ti Q1 na Q2). ndo). Tapande 5C). A mû a-isoprène use na Q1, na carte ti densité ni ayeke leke a-isoprène 10 kue so ayeke na yâ ti Q2. Na yâ ti RC-LH116, a leke a-molécule ota ti UQ10 so ayeke na chelate (Q1 ti si na Q3, tableau 5D), na a-molécule ni kue ayeke na mbeni densité so ayeke polele na yâ ti ngbongboro ni kue (tapande 5, D ti si na G). Na yâ ti abungbi use so, a yeke wara agroupe ti li ti quinone ti Q1 na ti Q2 so ayeke nzoni mingi (Foto S12F), na ala yeke sara kua gi na RC. Q1 ayeke na yanga ti dû ti W ti RC-LH114-W (Foto 1G na 5, C, D na E), na Q2 ayeke na tele ti ndo so abungbi QB dä (Foto 5, C, D) na F). A bata L-Trp143 na L-Trp269 so angbâ ndulu mingi na Q1 na Q2 na amû lege ti sala kusala na π-stacking (Foto 5, E na F, na Foto S12). L-Gln88, 3,0 Å ti oxygène so ayeke na tele ti Q1, ayeke mû lege na mbeni ngangu kamba ti hydrogène (Foto 5E); a bata ngbele ye so na yâ ti aRC kue gi na yâ ti songo so ayeke yongoro mingi (Foto S13). L-Ser91 ayeke na place ti Thr na yâ ti mingi ti ambeni RC (Foto S13), a yeke 3,8 Angstroms ti oxygène méthylique ti Q1, na a lingbi ti mû lege na abungbi ti hydrogène so ayeke ngangu pëpe (Foto 5E). Q3 ayeke pëpe na mbeni mbilimbili ye so ayeke sara si a yeke wara ngu, me a yeke na yâ ti ndo so ngu ayeke dä pëpe na popo ti kete mbage ti RC-M na kete mbage ti LH1-α 5 ti si na 6 (Foto 5, D na G). Q1, Q2 na Q3 wala a-quinone chélaté so ayeke nduru na ni ayeke nga na Tch. Na ngangu pëpe, Trv. Souche 970 na Blc. A yeke wara na yâ ti iris ni (9, 10, 12) mbeni ndo so a bata ni nzoni ti tene a bungbi a-auxiliaire ti quinone na yâ ti RC-LH1 (Foto S12G). A-UQ oku so a buba na yâ ti RC-LH116 ague oko nzoni na 5,8±0,7 ti a-UQ oko oko so a fa ni na lege ti chromatographie ti ngu so ayeke sara kua nzoni mingi (HPLC), na ngoi so a-UQ ota so a buba na yâ ti RC-LH114-W ayeke na gbe ti A-UQ so a mû mesure ni na yâ ti a-molécule 6,2±0,3 (Fig. lekengo ye.
A-polypeptide L na M so ayeke pseudo-symétrique oko oko ayeke na a-TMH oku na a yeke sara mbeni hétérodimère so abungbi dimère ti BChl oko, a-monomère ti BChl use, a-monomère ti bactériophage (BPh) use, nga na mbeni fer so ayeke ti Hème pëpe nga na mbeni molecule ti UQ10 oko wala use. Na lege ti dutingo ti abungbi ti hydrogène na ndo ti groupe ti acétone so ayeke na nda ni nga na bungbingo ti lo so a hinga ni na yâ ti Rps, a yeke wara a-caroténoïde na yâ ti kete mbage ti M, so a iri ni cis-3,4-déhydroorhodopin. Mara ti ye (25). A yeke wara na yâ ti membrane ti RC-H mbeni TMH oko so ayeke na yâ ti membrane ni. A leke yâ ti RC ni kue legeoko na akete kete ye ota ti RC ti mara ti nyama so ayeke na popo ti ala (tongana Rba). sphaéroïdes (ID ti PDB: 3I4D). A-macrocycle ti BChl na BPh, ngbongboro caroténoïde nga na fer so ayeke héme pëpe ayeke tingbi tele na yâ ti résolution ti abungbi so, legeoko tongana ti so groupe ti li ti UQ10 na ndo ti QA nga na quinone ti QB na RC-LH116 (Foto S15).
Na ngoi so a yeke wara a-RC use so ayeke na a-occupation ti site ti QB nde nde, a mû lege na e ti bâ achangement so ayeke si lakue na yâ ti conformation so ayeke gue oko na bungbingo ti QB quinone. Na yâ ti RC-LH116, a yeke wara quinone ti QB na yâ ti “proximal” so abungbi ni kue (26), me kangbingo yâ ti RC-LH114-W ayeke na quinone ti QB pëpe. A yeke wara pëpe mbeni quinone ti QB na yâ ti RC-LH114-W, ye so adö bê ndali ti so complexe ni ayeke sara kua, mingi ahon complexe ti RC-LH116 so ayeke na quinone ti QB so a leke ni nzoni. Atâa so a-anneau use ti LH1 ayeke na a-quinone omene tongaso, oku ayeke na yâ ti a-anneau ti RC-LH116 so a kanga ni, me gi ota la ayeke na yâ ti a-anneau ti RC-LH114-W so a zi ni . Akota ye so ayeke si na yâ ti tere ti zo alingbi ti fa so a yeke changé hio asite ti RC-LH114-W QB, a yeke sara si quinone ayeke sara kua hio na yâ ti complexe ni nga a yeke ngangu pëpe ti hon na yâ ti boucle ti LH1. A yeke na lege ni ti tene so UQ so ayeke na yâ ti RC QB ti RC-LH114-W alingbi ti duti ye so aga na peko ti mbeni ye so ayeke ngangu mingi nga so ayeke sara kua ngangu, na ndo ti QB ti RC-LH114-W so a sara si a ngbâ hio na yâ ti tournoi ti UQ La étape spécifique (l’entrée du site QB a été fermée la conformation ref.
Na yâ ti QB, a yeke sara si L-Phe217 ayeke tourné na mbeni ndo so alingbi pëpe na UQ10, ndali ti so a yeke sara si a yeke sara si a yeke ngangu ti tene a sara kua na kozo unité ti isoprène ti ngbongboro ni (Foto 6A). Na ndo ni, akota changement ti conformation so ayeke polele ayeke polele, mbilimbili hélice de (kete hélice so ayeke na yâ ti boucle so ayeke na popo ti TMH D na E) so na yâ ni a yeke sara si L-Phe217 ague na yâ ti poche ti bungbingo QB nga na rotation ti L-Tyr223 (Foto 6A ) Ti fâ yâ ti kamba ti hydrogène so ayeke na yâ ti cadre ti binding ti QB na M-4. site ni (Foto 6B). Hélice ti pivot na gbe ti lo, Cα ti L-Ser209 ayeke changé na 0,33Å, na L-Val221Cα ayeke changé na 3,52Å. A yeke wara pëpe achangement so zo alingbi ti bâ na yâ ti TMH D na E, so a lingbi ti zia ni na ndo ti mba na yâ ti abungbi use so kue (Foto 6A). Ti gue oko na ye so e hinga, so ayeke kozo ye so a leke na yâ ti RC ti naturel so akanga ndo ti QB. Tongana a haka ni na structure ni kue (QB-bound) afa so kozoni si a sara si quinone ni aga kete, a hunda ti tene a changé conformation ni ti tene a lï na yâ ti quinone ni. L-Phe217 ayeke tourné ti sara mbeni π-stacking so ayeke na yâ ti groupe ti li ti quinone ni, na hélice ni ayeke gue na gigi, na a mû lege na ngbongboro ti L-Gly222 nga na chaîne ti mbage ti L-Tyr223 ti sara mbeni réseau ti hydrogène so ayeke na mbeni structure ti hydrogène so ayeke stable (Foto 6, A na C).
(A) Dessin animé so abungbi hologramme (chaîne L, chaîne orange/M, magenta) na apo (gris), so na yâ ni a fa akota ye so angbâ na yâ ni na lege ti mbeni ye so akpa mbeni keke. UQ10 ayeke na mbeni barre ti jaune. Ligne so ayeke na akete point afa abungbi ti hydrogène so ayeke na yâ ti aye ni kue. (B na C) A yeke wara na yâ ti apolipoprotéine ni aye so ayeke na yâ ti a-anneau ni kue, so a fa na gigi oxygène ti chaîne ti mbage ti L-Phe217 so ayeke na bleu nga na L-Tyr223 so ayeke na couleur rouge. Sous-unité ti L ayeke orange; a yeke wara na yâ ti a-unité M na H couleur pëpe. (D na E) A-apolipoprotéine (D) nga na a-site ti RC QB kue (E) [couleur ni ayeke na lege ti (A)] nga na Thermophilus thermophilus PSII (vert, bleu na quinone ti plastique; ID ti PDB: 3WU2) Zia na place ni (58).
Na lege ti ndara, atâa so a yeke wara gbâ ti astructure ti RC so ayeke na QB pëpe so ayeke na LH1 pëpe, a changé conformation so a bâ na yâ ti étude so kozo awe. Azo so ayeke na yâ ti structure ti déplétion ti QB so alondo na Blc. viridis (ID ti PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (ID ti PDB: 1EYS) (28) na Rba. sphaéroïdes (PDB ID: 1OGV) (29), so kue ayeke ndulu ti duti oko na yâ bungbi ti ala ti QB kue. Tongana a bâ 3PRC nzoni, a bâ so akete kete ye ti sukulango na ngu ti LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ayeke tingbi tele na yanga ti ndo ti QB, ye so alingbi ti kanga lege na kiringo ti leke yâ ti aye ti ga mbeni ye so a kanga ni. Atâa so LDAO ayeke buba pëpe na oko ndo so ayeke na yâ ti 1EYS wala 1OGV, a leke aRC so na lege ti oko détergent ni tongaso a lingbi ti sara si a yeke wara oko ye so. A yeke wara na yâ ti cristal ti Rba. Sphaéroïdes RC so abungbi na cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) ayeke nga na mbeni ndo ti QB so a kanga ni. Me, na yâ ti aye so, ndo so ayeke na yanga ti N-terminal ti polypeptide ti RC-M (so ayeke sara kua na ndo ti bungbingo ti QB na lege ti kamba ti H ti résidu ti Tyr so ayeke na ndo ti hélice Q) ayeke mû mbeni conformation so ayeke ti zo pëpe, na a yeke gi nda ti changement ti conformation ti QB ni pëpe (30 ). Ye so adë bê ti e ayeke so a bâ pëpe mara ti deformation tongaso ti polypeptide M na yâ ti RC-LH114-W, so ayeke ndulu ti duti oko na ndo ti N-terminal ti RC-LH116 RC. A lingbi nga ti tene so na peko ti so a zi antenne ti LH1 so a sara ni na détergent, a leke a-apolipoprotéine RC so ayeke na yâ ti PDB, so a zi a-interne ti quinone nga na a-lipide so ayeke na yâ ti dû so ayeke na popo ti RC ni na yâ ti a-anneau ti LH1 so angoro ni ( 31, 32 ). RC angbâ ti sala kusala ngbanga ti so lo bata a-cofacteur kue, gi quinone QB so ayeke buba pëpe, so ayeke ngbâ lakue nzoni pëpe na so ayeke buba fani mingi na ngoi ti lekengo ye (33). Na ndo ni, a hinga so ti zi LH1 nga na a-lipide so ayeke na yâ ti RC alingbi ti sara ngangu na ndo ti akua, na tapande ti sara si fini ti P+QB-state so a kangbi yâ ni na charge aga nduru (31, 34, 35). Tongaso, a yeke na lege ni ti tene so dutingo ti bague ti LH1 ti ndo ni so angoro RC alingbi ti bata ndo ti QB so “a kanga ni”, na tongaso ti bata ndo ti ndo ni so ayeke nduru na QB ni.
Atâa so apolipoprotéine (so ayeke na QB quinone pëpe) nga na structure ni kue afa gi akete foto use ti tournoi ti ndo ti QB, ahon ti tene a yeke mbeni molongo ti aye so asi, ambeni ye afa so a lingbi ti kanga lege na bungbingo ni ti kanga lege na kiringo ti bungbi ni na lege ti hydroquinone Ti kanga lege na kangango lege ti substrat. A lingbi ti sara si quinolol na quinone so ayeke na tere ti ndo ti QB ti apolipoprotéine ni aduti nde, ye so asara si RC ake ni. Azo atene ngbene ye giriri so achangement so ayeke si na yâ ti conformation ayeke sara si a-quinone abungbi tere nga ti sara si a-quinone adë. Ngangu ti RC so a sara ni na glace ti sara si a-quinone adë na peko ti so ala sara ye alingbi na bingo ayeke buba (36); A-cristallographie ti rayon X afa so ye ti sioni so asi ndali ti so a-quinone ti QB akanga yâ ti mbeni ye so ayeke “yo” ndulu na 4,5 Å na ndo so ayeke na tele ti zo (26) , 37). A yeke na lege ni ti tene so, na yâ ti angu so ahon, a yeke wara gbâ ti azo so ayeke na popo ti apolipoprotéine na structure ti bague ni kue, so ayeke na peko ti kozo sarango ye ti quinone nga na zingo ndo ti QB.
RC ti mara ti II so a wara na yâ ti bungbi ti PSII ti ambeni bactérie so ayeke mû kobe na lumière nga na a-algue nga na akeke ayeke na mbeni ye so a bata ni nzoni (38). A leke yâ ti aye so a fa na yâ ti tableau 6 (D na E) ti fa mara ti ye so ayeke na popo ti aRC ti PSII na ndo ti QB ti RC ti bactérie. A hakango ye so ayeke mbeni tapande ti mandango ye na ndo ti aye so ayeke nduru mingi na popo ti aye so ayeke sara si quinone abungbi tere nga ti sara si a kiri na peko. Abuku so a sû kozo afa so achangement so ayeke si na yâ ti tere ti zo ayeke gue oko na PSII so ayeke sara si a-quinone adë ( 39, 40 ). Tongaso, tongana a bâ lege so a bata na RC na lege ti évolution, kode ti bungbingo ye so a bâ ni kozo pëpe alingbi nga ti sala kusala na ndo ti ndo ti QB ti PSII RC na yâ ti akeke so ayeke te kobe na lege ti oxygène.
Rps ΔpufW (so a zi pufW na ndo ni pëpe) nga na PufW-His (protéine-W so a zia marque na ndo ni na yanga ti C 10x so a fa ni na lege ti locus ti pufW so ayeke na yâ ti tere ti zo). palustris CGA009 so a fa ni na yâ ti mbeti ti e so e sara kozo (16). A yeke wara na yâ ti congélateur ni ambeni kete wungo ti acellule so ayeke na yâ ti PYE (5 g litre -1 oko oko) (so a bata ni na yâ ti LB na -80 °C, so na yâ ni a yeke wara 50% ( w/v) ti glycérol) ti protéine, ti levure nga na ti succinate (% ti succinate) ti agar/15. A zia plaque ni na bï na yâ ti bingo na ndo so dê ayeke dä pëpe, na pekoni a zia vuru lumière (~50 μmolm-2 s-1) so alondo na a-ampoule halogène ti OSRAM 116-W (RS Components, UK) teti lango ota ti si na lango oku juska mbeni colonie oko asigigi. A sala kusala na mbeni colonie oko ti zia na yâ ni 10 ml ti ngu ti M22+ (41) so a zia na yâ ni 0,1% (p/v) ti acide casamino (so a iri ni na pekoni M22). A lu culture ni na gbe ti mbeni ndo so oxygène ayeke dä mingi pëpe na yâ ti bingo na 34°C na a yeke yengi ni na 180 rpm teti angbonga 48, na pekoni a zia 70 ml ti culture ni na yâ ti oko ndo so teti angbonga 24. A yeke sala kusala na mbeni culture semi-aérobie so wungo ni ayeke 1 ml ti zia na yâ ni 30 ml ti ngu ti M22 na yâ ti mbeni bozo ti verre so ayeke na vis universel ti 30 ml na a zia wâ na ndo ni na lege ti agitation (~50μmolm-2 s-1) teti angbonga 48 na lege ti ngangu ti magnétique so ayeke stérile Stirring rod. Na pekoni, a mû 30 ml ti culture ni na litre 1 tongaso ti culture ni na yâ ti oko ye so, so na pekoni a mû ni ti zia na yâ ti culture ni litre 9 tongaso so a zia lumière na ndo ni na ~200 μmolm-2 s-1 teti angbonga 72. A mû a-cellule ni na lege ti centrifugation na 7132 RCF teti penze-ngbonga 30, a kiri a zia ni na yâ ti ~10 ml ti tris-HCl 20 mM (pH 8,0), na a bata ni na -20°C juska a hunda ni.
Na peko ti so a zi yâ ni awe, a zia ambeni cristal ti désoxyribonucléase I (Merck, Royaume-Uni), lysozyme (Merck, Royaume-Uni) nga na ambeni tablette use so ayeke kanga lege na holoenzyme ti Roche (Merck, Royaume-Uni) na yâ ti acellule so a kiri a leke ni. Na yâ ti mbeni cellule ti pression ti France so ayeke na psi 20 000 (Aminco, États-Unis), a fâ yâ ti acellule ni fani 8 ti si na 12. Na peko ti so a zi acellule so asuru pëpe nga na ambeni ye so alingbi ti lï na yâ ti ngu pëpe na lege ti centrifugation na 18 500 RCF teti penze-ngbonga 15 na 4°C, a zi membrane ni na yâ ti lysate so ayeke na pigment na lege ti centrifugation na 113 000 RCF teti angbonga 2 na 43 000°C. A zi mbage ti ngu so ayeke na yâ ti ngu ni na a kiri a zia membrane so ayeke na couleur na yâ ti 100 ti si na 200 ml ti tris-HCl 20 mM (pH 8,0) na a sara si a ga homogénéisé juska a yeke wara pëpe ambeni ye so abâ gigi. A zia na yâ ti tris-HCl 20 mM (pH 8,0) (Anatrace, États-Unis) so 2% (p/v) ti β-DDM ayeke na yâ ni teti ngbonga 1 na yâ ti bingo na 4°C na a yeke sara si a ngbâ ti ngbâ kete. Na pekoni, a zia na yâ ti centrifuge na 70°C ti tene a zia na yâ ti RCF 150 000 na 4°C teti ngbonga 1 ti zi tanga ti aye so ayeke na yâ ti ngu pëpe.
A yeke wara na yâ ti a-échange ti a-ion ti DEAE Sepharose so wungo ni ayeke 50 ml, na a yeke wara na yâ ni a-ion ota (CV) ti tampon ti bungbingo ye [20 mM tris-HCl (pH 8,0) so ayeke na 0,03% (p / v) ti β-DDM]. Sukula colonne ni na a-tampon use ti bungbingo CV, na pekoni sukula colonne ni na a-tampon use ti bungbingo ye so ayeke na NaCl 50 mM. A yeke wara na yâ ti RC-LH116 mbeni gradient so ayeke na ligne ti NaCl 150 ti si na 300 mM (na yâ ti tampon ti bungbingo ye) na ndo ti 1,75 CV, na a zia tanga ti abungbi ti bungbingo ye ni na mbeni tampon ti bungbingo ye so ayeke na NaCl 300 mM na ndo ti 0,5 CV. A bungbi spectre ti absorption so ayeke na popo ti 250 na 1000 nm, a bata mbage so ayeke na ratio ti absorption (A880/A280) so ayeke kota ahon 1 na 880 ti si na 280 nm, a dilué ni fani use na yâ ti tampon ti bungbingo ye, na a kiri a sala kusala na oko kode ni na ndo colonne ti DEAE Na ndo ti sukulango ngu. Dilué akete mbage so ayeke na A880/A280 so ayeke kota ahon 1,7 nga na A880/A805 so ayeke kota ahon 3,0, sara ota tour ti échange ti ion, na bata akete mbage so ayeke na A880/A280 so ayeke na A880/A280 so ayeke kota ahon 2,2 nga na A880/A805 so ayeke kota ahon 0. A zia na yâ ti mbeni filtre centrifuge ti Amicon 100 000 (MWCO) (Merck, Royaume-Uni), na a zia ni na ndo ti mbeni colonne ti zingo na yâ ni so akono Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, États-Unis) so ayeke na tampon ti NaM thelume na 200 ml. 1,5 CV. A bungbi a-absorption ti kota mbage ti exclusion ni, na a bungbi a-absorption so ayeke na a-A880/A280 na ndo ti 2,4 nga na a-A880/A805 na ndo ti 5,8 ti si na 100 A880, na hio a sara kua na ni ti leke na grille ti cryo-TEM wala ti bata ni na bezoin ti tene a bata ni na -til8.
A zia na yâ ti mbeni colonne ti Sépharose ti HisPrep FF Ni-NTA 20 ml (20 mM ti tris-HCl (pH 8,0) so NaCl 200 mM nga na 0,03% (p/p) ayeke na yâ ni) na yâ ti tampon ti IMca ( GE ). v) β-DDM]. A sukula colonne ni na CV oku ti tampon ti IMAC, na pekoni a mû na CV oku ti tampon ti IMAC so ayeke na histidine 10 mM. A yeke wara na yâ ti colonne ni a-élution ti IMAC oku so ayeke na histidine 100 mM. A yeke wara na yâ ti RC-LH114-W complexe ni ~10 ml na yâ ti mbeni réservoir so a sara ni na mbeni filtre ti Amicon 100 000 MWCO (Merck, Royaume-Uni), a dilué ni fani 20 na tampon ti bungbingo ye, na pekoni a zia na yâ ni 25 ml Na yâ ti tampon ti DEAE b four, kozoni. Sukula colonne ni na a-tampon ti bungbingo CV osio, na pekoni a-élué complexe ni na ndo ti a-CV osio na ndo ti mbeni gradient ligneux ti 0 ti si na 100 mM ti NaCl (na yâ ti tampon ti bungbingo ye), na tanga ti a-CV osio so ayeke na ratio ti tampon ti bungbingo ye ti 100 mM A-résidu ti complexe so a zia ni na ndo ti so8de2. 2,4 na A880/A805 so ayeke na 4,6 a yeke wara na yâ ti mbeni filtre centrifuge ti Amicon 100 000 MWCO, na a zia na yâ ni 1,5 CV IMAC kozoni. 1,5 CV. A bungbi a-absorption ti akete mbage ti kota-exclusion na a bungbi a-absorption so ayeke na a-A880/A280 na ndo ti 2,1 nga na a-A880/A805 na ndo ti 4,6 ti si na 100 A880, so a yeke sara kua na ni hio ti leke na a-grille ti TEM so a sara ni na glace wala ti bata ni juska na -80°C.
A sala kusala na mbeni congélateur ti Leica EM GP ti leke na a-grille ti TEM so ayeke na ngangu pëpe. A zia na yâ ti tampon ti IMAC A880 ti 50, na pekoni a zia 5μl na ndo ti mbeni fini maille ti cuivre so a sara ni na carbone so a sara ni na QUANTIFOIL 1,2/1,3 (Agar Scientific, Royaume-Uni). A yeke nzoni a zia grille ni na 20°C nga na 60% ti humidité teti 30 s, na pekoni a zia ni na yâ ti éthanol so ayeke ngu-ingo na -176°C.
A sû asango ti RC-LH114-W na ndo ti eBIC (Centre électronique de bioimagerie) (Source de lumière de diamant britannique) na mbeni microscope ti Titan Krios, so ayeke sara kua na mbeni tension so ayeke sara si lumière ni ague hio mingi, so ayeke na mbeni ngangu ti Choose so ayeke 130 000 ti e-2× na mbeni kota ye so ayeke sara si lumière ni aga kota. A sala kusala na mbeni Gatan 968 GIF Quantum so ayeke na mbeni ye ti gingo na akota tênë ti K2 ti sû na mbeti a-image na lege ti dikongo wungo ti aye ti bungbi na asango. Akota ti pixel so a calibré ni ayeke 1,048Å, na wungo ti dose ni ayeke 3,83 e-Å-2s-1. A bungbi film ni na yâ ti seconde 11 na a kangbi yâ ni na ambage 40. Lo mû ndo so a sara na carbone ti kiri ti bâ ndo na ndo ti microscope ni, na pekoni lo bungbi afilm ota na yâ ti dû oko oko. Na yâ ti afilm ni kue, a bungbi afilm 3130, na a-écart ti défocus ni ayeke na popo ti -1 na -3μm.
A bungbi asango ti RC-LH116 na lege ti oko microscope so ayeke na Laboratoire ti Biostructure ti Asterbury (Université ti Leeds, na Grande-Bretagne). A bungbi asango ni na lege ti dikongo wungo ti aye na mbeni kota ye ti 130 k, na a leke kota ti pixel ni na 1,065 Å na mbeni dose ti 4,6 e-Å-2s-1. A sara film ni na yâ ti seconde 12 na a kangbi yâ ni na ambage 48. Na yâ ti afilm ni kue, a bungbi afilm 3359, so wungo ti défocus ni ayeke na popo ti -1 na -3μm.
A yeke sara kua na asango kue na yâ ti tuyau ti Relion 3.0 (42). Lo mû Motioncorr 2 (43) ti leke na lege ti dose ti poids, na pekoni lo sara kua na CTFFIND 4.1 (44) ti hinga na paramètre ti CTF (fonction ti transfert ti contraste). A yeke wara na yâ ti tableau 2. S16 afoto so a mû na peko ti akozo kapa ti lekengo ye so. A leke modèle ti sorongo ye na lege ti automatique na lege so a soro na maboko ndulu na pixel 250 ti akete kete ye 1000 na yâ ti mbeni cadre ti pixel 250 na mbeni kangbingo yâ ti aye use (2D) ti référence pëpe, tongaso a ke kangbingo yâ ti aye so alingbi na saleté ti échantillon wala so ayeke na ambeni ye so zo alingbi ti bâ ni pëpe. Na pekoni, a soro ye na lege ti automatique na ndo ti akete foto kue, na RC-LH114-W ayeke na akete kete ye 849 359, na complexe ti RC-LH116 ayeke na akete kete ye 476 547. Akete kete ye kue so a soro ala ahon na yâ ti atour use ti kangbingo yâ ti aye so ayeke ti référence pëpe na 2D, na peko ti so a sara ni oko oko, a yeke ke akete kete ye so atingbi na ndo ti carbone, asioni ye so a mû na yâ ti échantillon ni, ambeni ye so ayeke polele pëpe wala akete kete ye so ayeke na ngangu na ndo ti mba, na ye so asara si a sara kua na 772 033 (90,9%) nga na 359,578 ti Parles3 ( )d . RC-LH114-W na RC-LH116 ayeke na yâ ni. A leke kozo model ti référence 3D na lege ti kode ti descendement ti gradient stochastique. Na salango kusala na kozo model ni tongana mbeni ye ti bango na ni, a kangbi yâ ti akete kete ye so a soro ni na yâ ti ambage osio na yâ ti 3D. Na lege ti model so ayeke na yâ ti kapa so tongana mbeni référence, sara kua na 3D ti leke na akete kete ye so ayeke na yâ ti kota kapa ni, na pekoni lo sara kua na kozo filtre ti 15Å ti kanga ndo ti solvant ni, lo zia na ndo ni apixel 6 ti akota bongo so ayeke moussé, na lo sara kua na a-pixel ni ti leke na Gatan K2 transfer function ti kota ndo ti Mo. Ti RC-LH114-W, a leke kozo model so na lege so a zi ngangu ti densité so ayeke na yanga ti masque ni (so a zi ni na yâ ti core complexe ti densité so ayeke na yâ ti UCSF Chimera). A yeke wara na yâ ti a-image ni (résolution ti RC-LH114-W na RC-LH116 so ayeke 3,91 na 4,16 Å) so a sara kua na ni ti sara na use kapa ti kangbingo yâ ti aye na lege ti 3D. A bungbi akete kete ye so ayeke na yâ ti akozo klase ti 3D na a yeke wara pëpe akpengba kamba na popo ti ala. Overlap wala mankengo ti aye so ayeke polele na yâ ti structure ni. Na peko ti use kapa ti kangbingo yâ ti aye na lege ti 3D, a soro mara ti azo so ayeke na kota résolution [Ti RC-LH114-W, mara oko ayeke a-particule 377 703 (44,5%), ti RC-LH116, a yeke wara a-particule use, so wungo ni kue ayeke 260 752 a-particule,552. na peko ti kozo tournée ni na mbeni kete kangbi]. A yeke kiri ti zi akete kete ye so a soro ni na yâ ti mbeni boîte so ayeke na pixel 400 na a yeke sara si a ga nzoni na lege ti 3D. A yeke sara kua na masque ti solvant ni na lege ti kozo filtre ti 15Å so ayeke na gbe ni, 3 pixel ti carte ti expansion nga na 3 pixel ti masque ti douce. Na lege ti CTF so a leke ni na particule oko oko, a leke mouvement ti particule oko oko nga na use tour ti CTF so a leke ni na particule oko oko, a leke ni na 3D, a sara masque ti solvant nga na post-traitement na peko ti aye oko oko ti tene a kiri a leke yâ ti texture so aga na pekoni. Na lege ti FSC (Coéfficient de corrélation de la coque de Fourier) so a fâ yâ ni 0,143, a yeke wara arésolution ti ndangba model ti RC-LH114-W na RC-LH116 so ayeke 2,65 na 2,80Å. A yeke wara na yâ ti tableau 2. S17 courbe ti FSC ti ndangba model ni.
A yeke wara na yâ ti ambeti ti e ambeni ye so a iri ni UniProtKB: LH1-β (PufB; ID ti UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; iri ti zo oko oko: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID ti UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID ti UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID ti UniProt: A0A4Z9); Protéine-W (PufW; ID ti Protéine oko: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) a sala kusala na ni ti leke na mbeni model ti homologie ti RC, so ayeke na yâ ni a-protéine ti RC-L, RC-M na RC-H nga na a-cristal ti Rba. sphaéroïdes RC so a sala kusala na ni tongana mbeni modèle (ID ti PDB: 5LSE) (46). Lo sara kua na “carte ti lingbingo na ni” na yâ ti Chimera ti UCSF ti lingbi na model so a sara ni na carte ni (47), ti leke yâ ti poroso ni nzoni, nga ti sara si a leke yâ ti protéine ni nzoni, nga ti sara kua na cofacteur [4×BChl a (iri ti résidu ti bibliothèque ti monomère = BCL), 2×BPh a (BPH), mara ti UQ10 oko wala use (U10), mbeni mara ti UQ10 oko wala use (U10), mbeni oko so ayeke ti heme pëpe nga na mbeni oko so ayeke ti heme pëpe. 3,4-dihydrohéxacarbonylcholine (QAK)] ti Coot (48) ti zia na ndo ni. Teti so QAK ayeke na yâ ti bibliothèque ti monomère pëpe, a paramètre ni na lege ti gbakuru ti eLBOW so ayeke na yâ ti PHENIX (49).
Na pekoni, a leke mbeni kete mbage ti LH1. Na tongo nda ni, a sala kusala na gbakuru ti lekengo ye na lege ti automatique na yâ PHENIX (49) ti leke na lege ti automatique mbeni mbage ti molongo ti LH1 na salango kusala na carte ni nga na molongo ti aprotéine LH1-α na LH1-β tongana ye ti lï na ni. Sorongo kete mbage ti LH1 so ayeke nzoni mingi, zi ni na zia ni na yâ Coot, zia na maboko ti mo molongo ti aye so amanke na yâ ni, na maboko ti leke yâ ti ye ni kue kozoni si mo zia na yâ ni BCls use a (BCL) nga na mbeni spirilloxanthine (CRT) [alingbi na Rps so alingbi na ni Densité ti complexe ti LH1 so ayeke na yâ ti carotène ni nga na ye so a hinga ni. Mara ti ye (17)]. Copié akete kete ye ti LH1 kue, na sala kusala na “Outil ti carte ti docking” ti UCSF Chimera ti dock na yâ ti ndo so ayeke na tele ni pëpe ti model ti densité ti LH1, na pekoni mo leke ni na Coot; kiri mo sara ye so juska a sara si a-unité ti LH1 kue aga model. Ti RC-LH114-W, na lege ti zingo akota ye so a kangbi ni pëpe na yâ ti Coot, a kangbi yâ ti poroso ni na yâ ti tanga ti ambage so ayeke poroso pëpe na yâ ti carte ti USCF Chimera na a sara kua na gbakuru ti Autobuild ti leke na kozo model ni, na tanga ti akete kete ye (protéine-W) Modeling. Na FÉNIQUE (49). A zia ambeni molongo so amanke na ndo ti model so aga na pekoni na yâ ti Coot (48), na pekoni a leke na maboko ti mo kete mbage ni kue. Atanga ti akota ye so a kangbi yâ ni pëpe alingbi na bungbingo ti a-lipide (ID ti bibliothèque ti monomère ti PDB ti CDL = CDL, POPC = 6PL na POPG = PGT), a-électrode ti β-DDM (LMT) nga na a-molécule ti UQ10 (U10). Lo sara kua na PHENIX (49) nga na manuel na yâ ti Coot (48) ti sara si kozo model ni kue aga nzoni juska a lingbi ti sara si a-étude ti model ni nga na nzoni bango ndo ti zo ni aga nzoni mingi. Na pekoni, lo sara kua na LocScale (50) ti sara si carte ti ndo ni aga nzoni, na pekoni lo sara ambeni cycle ti modelage ti densité so a mû ni pëpe nga na ti sarango si a-optimisation automatique nga na maboko aga nzoni.
A yeke wara na yâ ti a-image 1 na 2 a-peptide, a-cofacteur nga na ambeni lipide nga na a-quinone so abungbi na yâ ti a-densité ti ala. A fa asango ti statistique ti ndangba model ni na yâ ti Tableau S1.
Tongana a fa mbeni ye nde pëpe, a bungbi a-écran ti UV/Vis/NIR na ndo ti mbeni spectrophotomètre Cary60 (Agilent, États-Unis) na popo ti 1 nm so alondo na 250 nm ti si na 1000 nm nga na mbeni ngoi ti bungbingo ye so ayeke 0,1s.
Dilué échantillon ni na yâ ti mbeni cuvette ti quartz so ayeke na lege ti 2 mm ti si na A880 ti 1, na bungbi spectre ti absorption so ayeke na popo ti 400 na 1000 nm. A bungbi a-image ti dichroïque so ayeke na yâ ti mbeni spectropolarimètre ti Jasco 810 (Jasco, Japon) so ayeke na popo ti 400 nm na 950 nm na mbeni vitesse ti scanner so ayeke 20 nm min-1.
A yeke wara coefficient ti extinction molar na lege so a yeke dilué complexe ti core ni na mbeni A880 so ayeke ndulu na 50. Dilué volume ti 10μl na yâ ti tampon ti bungbingo ye wala méthanol 990μl, na bungbi spectre ti absorption ni hio ti tene BChl abuba mingi pëpe. A yeke wara na yâ ti échantillon ti méthanol oko oko wungo ti BChl so ayeke na yâ ti 771 nm ti 54,8 mM-1 cm-1, na a yeke wara na yâ ti ni (51). A kangbi yâ ti wungo ti BChl so a mû mesure ni na 32 (RC-LH114-W) wala 36 (RC-LH116) ti hinga wungo ti akota ye so ayeke na yâ ti core complexe ni, so na pekoni a yeke sara kua na ni ti hinga na spectre ti absorption ti oko échantillon so a bungbi ni na yâ ti tampon Coefficient ti Extinction. akpa tere. A mû amesure ota fani ota teti échantillon oko oko, na a mû moyen ti absorption ti BChl Qy so ayeke kota mingi ti sala na calcul. A yeke wara na yâ ti RC-LH114-W 3280±140 mM-1 cm-1, na a yeke wara na yâ ti RC-LH116 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 a yeke na lege ti kode so ayeke na yâ ti (52). Na nduru tënë, a sara kua na mbeni ye so a iri ni HPLC (RP-HPLC) so a iri ni Agilent 1200 HPLC. A yeke wara na yâ ti 50μl ti méthanol:chloroforme so ayeke na 0,02% (p/v) ti chlorure ti fer, na a yeke zia na yâ ti 0,02% ti chlorure ti fer so a leke ni kozo awe. 40°C na yâ ti mbeni ye so a iri ni HPLC (80:20 méthanol:2-propanol) na ndo ti mbeni colonne so ayo ×25 cm. A yeke sara kua na mbeni ye so a iri ni HPLC ti bâ wala a yeke mû ngu na 275 nm (UQ10), 450 nm (caroténoïde) nga na 780 nm (BChl) teti ngbonga 1. A yeke wara na yâ ti chromatogramme ti 275 nm so ayeke na penze-ngbonga 25,5, so na yâ ni a yeke wara ambeni ye nde so a lingbi ti hinga ni pëpe. A yeke wara na yâ ti a-intégration ni akota wungo ti UQ10 so a zi ni na lege ti courbe ti étalonnage so a diko ni na lege ti injection ti a-étalon so ayeke nzoni-kue so alondo na 0 ti si na 5,8 nmol (Foto S14). A bâ échantillon oko oko na yâ ti a-échantillon ota, na afaute so a fa ague oko na SD ti moyenne ni.
A leke mbeni solution so ayeke na yâ ti RC-LH1 so ayeke na mbeni kota wungo ti Qy so ayeke 0,1 na 30 μM ti cytochrome c2 ti bê ti ambarata (Merck, Royaume-Uni) nga na 0 ti si na 50 μMUQ2 (Merck, Royaume-Uni). A leke a-échantillon ota ti 1-ml na ndo ti akota wungo ti UQ2 oko oko na a zia ni na bï na yâ ti bingo na 4°C ti tene a lingbi kue na bingo ni kozoni si a mû mesure ni. A zia solution ni na yâ ti mbeni spectrophotomètre modulaire OLIS RSM1000 so ayeke na mbeni grille ti ligne ti wâ/500 ti 300 nm, mbeni dû ti lïngo na ni so ayeke 1,24 mm, mbeni dû ti lingo ni so ayeke 0,12 mm na popo ni nga na ayanga ti sigingo ni so ayeke 0,6 mm. A zia mbeni filtre so ayo 600 nm na yanga ti fototube ti échantillon ni nga na tube ti fotomultiplicateur ti référence ti zi lumière ti excitation. A yeke wara na yâ ti absorption ni 550 nm na ngoi ti bungbingo ye ni ayeke 0,15 s. A yeke wara lumière ti 880 nm M880F2 (Diode so ayeke mû lumière) (Thorlabs Ltd., Royaume-Uni) na lege ti mbeni kamba ti fibre optique so ayeke na ngangu ti 90% na lege ti mbeni ye ti komande DC2200 (Thorlabs Ltd., Royaume-Uni) na a yeke sigigi na ndo ti lumière ni na angle ti°9. A yeke zia lumière ti mesure ni na tele ti tatara ti kiri na lumière kue so échantillon ni agbu ni pëpe na tongo nda ni. Mo yeke wara absorption 10 s kozoni na lumière ti 50 s. Na pekoni, a kiri a bâ lege ti ngu ni teti 60 s na yâ ti bingo ti bâ wala quinolol ayeke sara si cytochrome c23 + adë na lege ti fä (bâ tableau S8 ti wara asango so ayeke na lege ni pëpe).
A sala kusala na asango ni na lege so a leke mbeni tongo nda ti ligne na yâ ti 0,5 ti si na 10 s (a lingbi na wungo ti UQ2) na a sala moyenne ti wungo ti a-échantillon ota kue na wungo ti UQ2 oko oko. A yeke wara na yâ ti mbeti ti RC-LH1 so a sara kua na ni ti changé wungo ti aye so ayeke na yâ ti ngu ni, so a sara ni na yâ ti Origin Pro 2019 (OriginLab, États-Unis), na a zia ni na yâ ti model ti Michaelis-Menten ti hinga wungo ti Km na Kcat so ayeke na lê ti zo.
Ti mû lege ti hinga ye so ayeke si na yâ ti ngu, a mû échantillon ti RC-LH1 na ~2μM na yâ ti tampon ti IMAC so ayeke na 50 mM ti ascorbate ti sodium (Merck, États-Unis) nga na 0,4 mM ti Terbutine (Merck, États-Unis). A yeke sala kusala na acide ascorbique tongana mbeni ye ti mungo a-électron ti sandaga, na a yeke sala kusala na tert-butaclofen tongana mbeni ye ti kangango lege na QB ti sala si kota ye ti mungo RC angbâ ti kiri na gbe ni (so ti tene, a yeke photooxydé pëpe) na yâ ti kusala ti mesure ni kue. A yeke zia ndulu na 3 ml ti échantillon na yâ ti mbeni cellule so ayeke tourné na lege ti kode (so diamètre ni ayeke ndulu na 0,1 m, 350 RPM) so yongo ti lege ti optique ni ayeke 2 mm ti tene échantillon so ayeke na yâ ti lege ti laser ni aduti na ngoi so alingbi ti sala si bingo aduti nzoni na popo ti a-pulse ti excitation. Lo mû a-échantillon ti laser so ayeke na ~100-fs ti sara si a-échantillon ni alondo na 880 nm na mbeni vitesse ti kiringo na peko ti 1 kHz (20 nJ ndali ti NIR wala 100 nJ ndali ti Vis). Kozoni ti bungbi asango, zia échantillon ni na gbe ti lumière ti excitation teti penze-ngbonga 30 tongaso. Ti fa ni ayeke sara si QA ayeke sara kua pëpe (peut-être a yeke sara si QA adë fani oko wala use). Me, pardon, hinga so a lingbi ti kiri na peko ti ye so ndali ti so na peko ti mbeni ngoi ti sarango ye alingbi na bingo, RC ayeke kiri yeke yeke ti sara kua ti QA. A sala kusala na mbeni ye ti bango na lege ti fä ti Helios (Ultrafast Systems, Amerika) ti mû mesure ti akete kete ye so ayeke hon gi hio tongaso na ngoi ti retard ni ayeke -10 ti si na 7000 ps . Lo sara kua na logiciel Surface Xplorer (Ultrafast Systems, États-Unis) ti zi yâ ti asango ni, na pekoni lo bungbi ni na lo sara si a lingbi na ni. Lo sara kua na logiciel CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituanie) ti sara kua na abungbi ti asango so abungbi ti wara a-écran so ayeke nde so andu futingo ti ye, wala lo sara kua na mbeni fonction so abungbi a-exponent mingi na kiringo tënë ti aye ti kua ni ti lingbi na évolution ti a-écran so ayeke na mbeni yongo ti onde oko na yâ ti OriginLa (Origin).
Tongana ti so a fa ni na nduzu ge (53), a leke mbeni film ti photosynthèse so ayeke na yâ ni complexe LH1 so ayeke na antenne ti RC nga na ti LH2 so ayeke na tele ni pëpe. A zia membrane ni na yâ ti tris 20 mM (pH 8,0) na a zia ni na yâ ti mbeni cuvette ti quartz so ayeke na mbeni lege ti bango ndo so ayo 2 mm. A sala kusala na mbeni pulse ti laser ti 30nJ ti pusu échantillon ni na 540 nm na mbeni ngoi ti retard ti -10 ti si na 7000 ps. Processus ti ensemble ti asango tongana ti so a fa ni ndali ti Rps. pal échantillon.
A sala si membrane ni aga pellet na lege ti centrifugation na 150 000 RCF teti angbonga 2 na 4°C, na pekoni a kiri a zia na yâ ti tris-HCl 20 mM (pH 8,0) nga na NaCl 200 mM. A yeke nzoni ti tene a zia na yâ ti membrane ni 2% (p/v) ti β-DDM teti ngbonga 1 na yâ ti bingo na 4°C. A zia na yâ ti échantillon ni 100 mM ti carbonate ti triéthylammonium (pH 8,0) (TEAB; Merck, Royaume-Uni) ti wara na mbeni protéine so ayeke 2,5 mg ml-1 (analyse ti Bio-Rad). A sala ambeni kusala nde na lege ti kode so a sigigi na ni kozoni awe (54), ti to nda ni na ziango na yâ ni 50 μg ti protéine na yâ ti mbeni 50 μl ti TEAB kue so ayeke na 1% (p/v) ti laurate ti sodium (Merck, Royaume-Uni). Na peko ti so a sara kua na sonication teti penze-ngbonga 60, a sara si a zia na yâ ti ngu ni 5 mM ti tris (2-carboxéthyl)phosphine (Merck, Royaume-Uni) na 37°C teti penze-ngbonga 30. Ti sara si a sara S-alkylation, a lingbi a zia na yâ ti échantillon ni 10 mM ti méthyl S-méthylthiométhanesulfonate (Merck, Royaume-Uni) na a zia ni na yâ ti mbeni solution ti stock ti isopropanol 200 mM teti penze-ngbonga 10 na ndo ti chambre. A yeke sara kua na 2 μg ti trypsine/endoprotéinase Lys-C (Promega UK) na a zia ni na yâ ti 37°C teti angbonga ota. A yeke wara na yâ ti mbeti ni 50 μl ti éthyl acétate nga na 10 μl ti acide trifluoroacétique ti grade LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) na a yeke sara si a ngbâ na yâ ti ngu ni teti 60 s. A kangbi yâ ti aphase ni na lege ti centrifugation na 15 700 RCF teti penze-ngbonga 5. Na lege ti kode ti azo so asala ni, a sala kusala na mbeni colonne ti spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) ti mû nzoni na ti zi ngu na yâ ti akete mbage so ayeke na yâ ti peptide ni. Na peko ti so a sara si a ngbâ ti sara kua na 0,5% ti TFA nga na 3% ti acétonitrile, na a sara kua na 500 ng na lege ti chromatographie RP so abungbi na spectrométrie ti masse na lege ti aparamètre ti système so a fa ni kozo awe.
Lo sara kua na MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ti hinga na aprotéine nga ti hinga wungo ti ala ti gi na Rps. palustris (www.uniproteome/UP000001426). A zia asango ti proteomique ti spectrométrie ti masse na yâ ti Alliance ti ProtéomeXchange na lege ti ndo ti batango asango ti PRIDE (http://protéomecentral.protéomexchange.org) na gbe ti identifiant ti bungbi ti asango PXD020402.
Ti gi nda ti ye na lege ti RPLC so abungbi na spectrométrie ti masse ti ionisation électrospray, a leke bungbi ti RC-LH1 na lege ti Rps ti ngonda. Na lege ti kode so a sigigi na ni kozo awe (16), wungo ti aprotéine so a wara na yâ ti acellule ti palustris ayeke 2 mg ml-1 na yâ ti Hepes 20 mM (pH 7,8), NaCl 100 mM nga na 0,03% (p/v) β- (analyse Bio-Rad) ) DDM. Na lege ti protocole ti azo so asala ni, sala kusala na kit ti sukulango ngu 2D (GE Healthcare, Amerika) ti zi na yâ ni 10 μg ti protéine na lege ti kode ti ziango ngu na yâ ti ngu, na ti zia na yâ ti 20 μl ti acide formique (FA) 60% (v / v), 20% (v / v) ti Acétonitrile nga na 20% ti ngu (vvv). A yeke wara na yâ ti ambeti ti e ambeni ye so a iri ni RPLC (Dionex RSLC) so a sara ni na lege ti spectrométrie ti masse (Maxis UHR-TOF, Bruker). Lo mû na ala mbeni colonne ti MabPac so ayo 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) ti kangbi yâ ti ngu ni na 60°C nga na 100μlmin -1, na mbeni ngbongboro ngu so ayeke na 85% (v / v) ti ngu A [0,1% (v / v) ti FA nga na 0,02% (V/v) ti ngu ti TFA ti B5 a. [0,1%(v/v) ti FA na 0,02%(v/v) na yâ ti 90%(v/v) ti TFA ti acétonitrile] Na salango kusala na source ti ionisation électrospray so ayeke na lege ni nga na aparamètre ti defaut teti penze-ngbonga ahon 60, spectromètre ti masse ni ayeke wara 100 ti si na 2750 m/z (ratio ti masse na charge). Na lege ti mungo maboko ti gbakuru ti FindPept ( https://web.expasy.org/findpept/), a sala carte ti spectre ti masse ti akete ye ti yâ ti bungbi ni.
A zia na yâ ti acellule ni teti angbonga 72 na gbe ti lumière ti NF so ayeke kete (10 μMm-2 s-1), so ayeke na popo-hoto (30 μMm-2 s-1) wala so ayeke kota (300 μMm-2 s-1). M22 (M22 so na yâ ni a zi sulfate ti ammonium na a zia succinate ti sodium na place ni) na yâ ti mbeni bozo so a sara ni na vis so wungo ni ayeke 100 ml (23). Na yâ ti acycle oku ti 30-s, a zia ambeni perle ti verre so ane micron 0,1 na yâ ti mbeni volume ti 1:1 ti tene a lysé acellule ni na a zia ni na ndo ti glace teti penze-ngbonga 5. A zi aye so ayeke lï ngu pëpe, acellule so asuru pëpe nga na akete perle ti verre na lege ti centrifugation na 16 000 RCF teti penze-ngbonga 10 na yâ ti mbeni microcentrifuge so ayeke na ndo ti banc. A kangbi yâ ti membrane ni na yâ ti mbeni rotor ti Ti 70,1 so ayeke na RCF 100 000 na yâ ti tris-HCl 20 mM (pH 8,0) so ayeke na mbeni 40/15% (p/p) ti sucrose teti angbonga 10.
Tongana ti so a fa na yâ ti mbeti ti e so ahon, immunodétection ti tag ti Lo na ndo ti PufW (16). Na nduru tënë, a purifié core complexe (11,8 nM) wala membrane so ayeke na oko wungo ti RC (so a hinga ni na lege ti oxidation so a zi spectre ti différence so adë na a lingbi na kungba so ayeke na ndo ti gel so a sara na couleur) na yâ ti tampon ti chargement ti SDS 2x (Merck, Royaume-Uni) so a dilué ni fani use. A kangbi yâ ti aprotéine ni na ndo ti mbeni réplique ti gel ti NuPage so ayeke na 12% ti bis-tris (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni). A zia na yâ ti mbeni gel so a sara ni na bleu brillant ti Coomassie (Bio-Rad, Royaume-Uni) ti tene a zia na yâ ti ni na a bâ na yâ ti li ti zo akete kete ye so ayeke na yâ ti RC-L. A mû protéine so ayeke na ndo ti use gel ni na a zia na yâ ti mbeni membrane so a sara ni na méthanol (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) ti tene a sara mbeni ye ti bâ wala a yeke na kobela ni. A kanga yâ ti membrane ti PVDF ni na yâ ti tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, Tween-20 0,2% (v/v) nga na 5% (p/v) ti warango ngu so a sara ni na bongo pëpe, na pekoni a zia na yâ ni mbeni ye so ayeke sara si zo awara kobela pëpe (na yâ ti tampon ti mHC5 7,6), NaCl 150 mM na Tween-20 0,05% (v/v)] na yâ ti 1:1000 A190-114A, Laboratoire ti Béthyl, États-Unis) teti angbonga 4. Na peko ti so a sukula ni fani ota teti penze-ngbonga oku na yâ ti tampon ti anticorps, a bungbi membrane ni na peroxydase ti réglisse (Sigma-Aldrich, Royaume-Uni) so ayeke tiri na ngbo (so a dilué ni 1:10 000 na yâ ti tampon ti anticorps so ayeke na gbe ni) A zia na yâ ti ngu ni ti mû lege ti hinga ni (penze-ngbonga oku na peko ti so a sukula ni fani ota na yâ ti tampon ti anticorps so a iri ni CARMImine C. (Cyanagène, Italie) nga na mbeni masini ti fango na tënë ti GE, Royaume-Uni).
Na lege ti dessin ti kangbingo yâ ti ngangu ti gel oko oko so a sara na tache wala ti lege ti immunoassay, bungbingo ndo so ayeke na gbe ti ngbongboro ni na diko wungo ti ngangu ti RC-L (gel so a tache ni) nga na Protéine-W (immunoassay), na yâ ti ImageJ (57) Processé l’image. A leke a-écart so ti ga a-écart ti molar na lege so a mû so a-échantillon ti RC-L na protéine-W so ayeke na yâ ti échantillon ti RC-LH114-W so ayeke nzoni-kue ayeke 1:1 na a normalisé a-échantillon ni kue alingbi na ni.
Ti wara ambeni ye nde ti wara na yâ article so, bâ ndo na ndo ti site ti e.
A yeke mbeni article so a kangbi ni na lege ti andia ti Creative Commons. Article ni amû lege ti sala kusala na ni, ti kangbi ni, na ti kiri ti sala ni na mbeni lege nde sân ti tene a kanga lege na ni, gi tongana a fa iri ti kozo mbeti ni nzoni.
Note: E hunda gi na mo ti mû adresse e-mail ti mo tongaso si zo so mo recommandé lo na ndö ti page ni ahinga so mo ye ti tene lo bâ e-mail ni nga so a yeke spam ape. A yeke mû ande pëpe adresse ti e-mail.
A yeke sara kua na hundango ndo so ti tara wala mo yeke mbeni vizite nga ti kanga lege na tokuango asango ti spam automatiquement.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Élisabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Hirmain C.
Akota ye so ayeke na yâ ti a-appareil ti gbungo na lumière 1 so ayeke na yâ ti centre ti réaction ni ayeke mû lege na e ti hinga afini ye na ndo ti ngangu ti quinone.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Élisabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Hirmain C.
Akota ye so ayeke na yâ ti a-appareil ti gbungo na lumière 1 so ayeke na yâ ti centre ti réaction ni ayeke mû lege na e ti hinga afini ye na ndo ti ngangu ti quinone.
©2021 Bungbi ti Amerika ti guengo na li ni ti senda-ye. a yeke bata droit kue. AAAS ayeke mbeni mba ti HINARI, AGORA, OARE, CHORALE, CLOCKSS, CrossRef na COMPTEUR. ISSN 2375-2548 ti senda-ye.